表達蛋白檢測實驗_點印跡法

抗外源蛋白抗體細胞懸液

PBS／Tween（含和不含 BSA）

[125I] 標記的蛋白 A離心管離心機1 ml 注射器的活塞點跡儀硝酸纖維素膜24 孔培養板

1. 病毒感染細胞并完成篩選（見「痘苗DNA檢測實驗」中「PCR 法」步驟 1~9）。

2. 輕輕刮下細胞，轉移到離心管中，最大轉速離心 30 s，棄培養基，用 200 μl PBS 重懸。24 孔培養板中的細胞也可用 1 ml 的注射器的活塞刮取。

3. 凍融并超聲細胞懸液（見「痘苗DNA檢測實驗」中「PCR 法」步驟 11、12）。

4. 將硝酸纖維素膜剪至適合點跡儀大小，將其用水浸濕，放入儀器中，每孔中加入 20~100 μl 的細胞懸液（步驟 3），用抽吸的方法使液體流過硝酸纖維素膜，隨后將膜取出。

5. 用含 4% BSA 的 PBS/Tween 浸潤硝酸纖維素膜 30 min，用不含 BSA 的 PBS/ Tween 洗 1 次。

6. 將外源蛋白抗體用最小體積的 PBS/Tween 以 1:50～1:5000 稀釋，與膜室溫孵育 ≥ 1 h。

7. 用大體積 PBS/Tween 清洗膜 5 次。

8. 用含有 1 μCi/ml [?¹²⁵I ] 標記的蛋白 A 的最小體積 PBS/Tween 與硝酸纖維素膜孵育 30 min。此外，化學發光檢測系統（如 Amersham ECL）也可檢測抗體。

9. 用大體積 PBS/Tween 清洗膜 5 次。

10. 用塑料薄膜將硝酸纖維素膜包好，X 射線膠片放射自顯影。

1. 所有培養都在加濕的 37℃ 5% CO₂?培養箱中培養，除非有特殊說明。

2. 與活細胞接觸的器械和試劑都應該是無菌的，操作也必須無菌。

3. 除用重組蛋白抗體替換抗痘苗病毒抗體之外，可用「雞胚成纖維細胞制備實驗」、「MVA病毒儲液制備實驗」介紹的免疫染色法對含有噬斑的感染細胞進行原位染色。