核酸適配體篩選實驗的難點在哪里
首先它確實是比較難，但是SELEX實驗的難和其它實驗的難是不太一樣的。像做單分子成像，或者某些超靈敏的檢測類的實驗，很多時候受制于我們的客觀條件，受制我們所擁有的儀器設備。可是，核酸適配體的篩選與這些實驗不同，因為SELEX實驗它所用的儀器設備條件其實都非常簡單，幾乎所有的分子生物學實驗室都具備。那么問題就來了，它的難到底難在什么地方？為什么看似簡單的實驗，大家會覺得很難呢？【當然，我也覺得挺難的】
我最開始接觸SELEX實驗的時候，我也不認為它難，直到做了幾年之后，啥也沒篩選出來的時候，才發現它真的不像我之前想象的那么簡單，并不僅僅是那么幾個簡單的分子生物學實驗完成了就可以的。它的難到底難在什么地方呢？不是難在這個實驗操作上有多難，而是難在我們對這個實驗的理解上。
關于篩選難這一點，我認為是大家可以想象到。如果說這個實驗真的那么簡單的話，那么為什么那么多人篩選不出來呢？不就是那么幾個簡單的分子生物學實驗嗎？所以這里面一定有它的原因。而這種原因，恰恰難在很大程度上，這種原因到現在還是未知的。也就是說，我們不知道為什么失敗了，這才是真正難的地方。如果說我們知道我們為什么失敗，由什么原因導致失敗，那么我們去克服就可以了，我相信憑中國現在的實力，中國的研究條件和中國人的智慧沒有什么能夠難倒我們的。但是為什么這個事情讓我們覺得很難，因為我們不知道，我們不明白，我們不理解其中的原因。
下面我想先說說，從我們實驗室來說，我們覺得它難在什么地方？
核酸適配體篩選，其實可以分成兩個大的部分，第一個部分主要是重復性的操作，一輪一輪的篩選實驗。就是結合、分離、PCR擴增、單鏈制備、再篩選等等這樣一個循環過程。我認為這部分實驗對我們實驗室來說，這部分不是大問題，我們能夠保證正確的進行，而且這個時間的話，通常來說，如果是篩選一個單一的靶標，不管是小分子還是蛋白，我們基本上能夠在兩周之內完成全部篩選。如果稍微加快一些的話，基本可以在一周之內完成篩選過程。
對于我們來說，目前的難點在什么地方呢？主要是難在后期的鑒定。我們可以想象一下，在前面的篩選過程當中，我們可以從10的15次方的文庫當中，找到那么幾千條、幾萬條、或者幾百條不同的序列構成的一個文庫，這個文庫如果是有親和力的，說明前面篩選是成功的。但是獲得這個文庫之后，并不代表我們實驗就已經成功了，我們還需要從這樣一個文庫當中去找到真正能夠結合的單一序列，所以這個時候我們就要去做下一步的工作，需要去做測序，對測序結果進行分析，然后再做合成，再做進一步的鑒定，這步恰恰是我們目前的難點所在。
為什么說這一步是難點呢？因為我剛才說到了，前面的篩選過程，對我們實驗室來說通常一個人需要1~2周的時間，而后面這個階段，從測序、分析、挑選系列到合成，再到后面的鑒定要重復驗證，而這個過程是非常的漫長，我們甚至需要兩個月或三個月的時間才能夠完成，而且后期的成本其實是高于前期成本的。
而且針對不同靶標這一部分的檢測手段，差異性比較大。篩選時，篩選不同的小分子，我可以用類似的方法去篩選，但是我要去做親和力檢測時，很多時候不同的小分子、不同的靶標，需要用不同的方法，這也決定了后面整個實驗的一個難度。
有很多人覺得后期的鑒定不就是一個例行的檢測嗎，例行的實驗驗證嗎？為什么我們會覺得難呢？這邊還有一個問題，我們在前面的篩選的時候，我們從10到15次方的文庫得到很少的一些序列，比如說幾萬條這樣一個文庫，但是我們在做鑒定的時候，我們往往只能去合成及少量的序列，幾條十幾條或幾十條這樣的序列去做后期的驗證。如果鑒定更多序列，成本很高，時間投入也很大。我們通過大量的高通量測序和無數個驗證實驗，發現那些高親和力的序列，未必是那些富集率很高的序列。相反，那些富集程度很高的序列，往往并不見得是親和力最高的，甚至它們根本沒有親和力。所以這給我們帶來一個困擾，那就是我們到底該挑選哪些序列去做合成和驗證呢？如果說我們僅僅是挑選那些富集程度高的話，我們極有可能會錯過那些真正有價值的序列。
怎么能保證你不會錯過有價值的適配體呢？那就是在你不了解的情況下，要盡可能多去合成一些序列。那么每多合成一條都會增加成本，而每多檢測一個都會增加你后期實驗的難度。所以這一步對我們來說是一個瓶頸，我們實驗室目前的研究方向，在方法這一塊主要是提升后續鑒定的通量，譬如通過單分子的方法，通過高超的測試方法，通過芯片的方法，通過流式的方法等等這一系列技術，這是我們目前關注的重點。
上面說道，我們實驗室的前面做的比較快，后面是一個瓶頸，那是不是意味著我們現在所有的都能夠篩選成功了呢？其實不是，我們實驗室的篩選成功率盡管是相對比較高的，但是我們依然會面臨很多失敗的情況。這也是SELEX的難點所在。它難在什么地方，我想再做一點分析。
再回到剛開始我說的，為什么這些簡單的分子生物學實驗我們會失敗呢？這里面其實因為整個篩選實驗是一個長周期的實驗，我們可能要篩選幾周或者更長的時間。大家可以想象一下，當你去做一個實驗，如果說你需要做很長時間，而中途你又不知道這個實驗對還是不對，當你做了幾周或者幾個月之后，你發現你的實驗失敗了，那種感覺是非常令人沮喪的。而這個時候你怎么去分析原因呢？因為步驟很多，時間跨度很長，你甚至記不清楚開始是怎么做實驗的，你甚至沒有記下來開始用什么樣的條件，所以這個時候你盡管失敗了，你根本不知道失敗在什么地方，你即便再去重復一次，你可能也很難找到失敗的原因。所以，SELEX實驗難的一個重要原因是它缺少一些中間過程的監測點，無法及時給你提供反饋，無法及時告訴你中間的實驗步驟是對還是錯。
你可能會想到，我篩選的時候去測親和力不就可以了么？其實對于多數靶標的篩選來說，在早期的時候，在前面幾輪的時候，你是根本看不到有任何親和力的，那么這個時候你怎么去判斷正確還是錯誤，是該繼續還是該放棄呢？
這還沒有一個非常好的方法，所以在過去的六七年的時間里，我們花了很大時間去建立這樣一個監測指標，去判斷篩選是否在朝正確道路上走。這就涉及到整個篩選進程的監測。
說到篩選進程監測這一塊，其實也有不同的方法。基本的原理是兩個，第一個就是檢測結合的情況，是看看有沒有親和力，有沒有比前一輪結合的更多一些，那這是一個非常重要的標準，這種方法的話也是比較重要的一個方法，也是比較客觀的，但是有時候你還是找不到一個合適的方法，幫你去衡量它結合量多還是少。在這一部分我們一般使用結合比的方法來進行定量，就是每一輪我去觀觀測它結合比有沒有提升。
另外一種監測篩選進程的方法是看每一輪獲得文庫的庫容變化，就是隨著篩選的進行庫容是否在下降，按照一般的規律來說，隨著篩選進程進行，你的庫容會逐步降低，這也是一個判斷指標。但是庫容僅僅是一個參考指標，它不是一個篩選成敗的金標準。也就是說你的庫容如果在降低，說明正在富集，但它并不代表你的篩選是成功的。但是這種方法也有它的一個好處，就是可以幫助你判斷篩選的終點。就是當你篩選幾輪之后，你發現庫容很小的時候，如果你依然檢測不到親和力，那么你就可以認為篩選是失敗的。因為，當庫容很低的時候，文庫中的分子數非常少，如果還沒有檢測到有親和力，極有可能在早期，高親和力的分子被丟掉了。這個時候，你就可以果斷放棄了。所以這種監測庫容的方法，盡管它不能夠明確告訴你，你的篩選是否正確，但是它可以幫助你去判斷你是否該放棄還是該繼續，所以這也是一個非常重要的指標，這個方法的話大家可以參考我們發表的文章（參考這里：https://pubs.rsc.org/en/content/articlehtml/2017/an/c7an01131h??）。
篩選真正難在什么地方呢？就是核酸適配體有很多機理性的問題沒有搞清楚，舉一個簡單例子就是核酸適配體，它的結構會受它所處的溶液環境，pH值，離子強度，陽離子的種類等因素影響。這些都會影響到折疊，而折疊就會影響它的功能。但是這些因素怎么去影響的呢？到底會有什么樣的影響？然后這些因素又會對結構帶來什么樣的變化，以及這種結構與功能的關系，這些方面研究還非常的欠缺，所以就導致我們在使用一個適配體的時候，當我們發現它的功能不能重現的時候，也許是它的結構折疊發生變化，但我們目前缺少非常靈敏的監測結構變化的手段。如果對于單個適配體來說，我們可以準備大量的樣品，用CD來檢測，也可以去結晶，或者做核磁。但是所有這些方法都是極其低效極其昂貴的。所以，如果從基礎研究層面來說，核酸適配體篩選的難點來自于基礎研究的欠缺，特別是結構與功能研究的欠缺，在往底層說，其實就是核酸結構研究手段的欠缺。
為什么這么說？我們可以看一下目前核酸結構的主要研究手段。主要X-ray晶體衍射，以及NMR，但是這兩個手段目前都不太適合于研究核酸。譬如核磁，它只能研究比較小片段的核酸序列，目前的話通常在30個以下會比較容易研究，那X-ray的話, 如果核酸適配體不能夠長出晶體的話，也很難去研究。核酸適配體結構具有一定的柔性，所以有些人會把它和它的靶標放在一起共結晶得到這個復合物晶體，然后再去解決結構，但是多數的核酸適配體很難去長出晶體來，這也導致絕大部分的核酸適配體沒有結構信息，導致我們不知道它的結構是什么樣的。目前另一個非常火熱的研究大分子結構的手段，冷凍電鏡技術。冷凍電鏡目前它很難去做小分子的結構，而且核酸適配體它的結構是一個柔性的，所以即便是成像了也很難去做疊加分析，加上核酸適配體本身比較小，冷凍電鏡也是無能為力的。所以目前三大主流研究結構的技術晶體衍射，核磁和冷凍電鏡對核酸適配體都無能為力。正式因為這種底層的基礎研究數據缺乏，導致我們對核酸適配體結構功能關系缺少深入的理解。當我們碰到問題的時候，我們很難從底層，從結構功能角度去做一些分析。這就是說真正基礎性的研究欠缺，導致我們在篩選層面，以及在應用層面碰到很多問題的時候，我們不知道如何去解釋。這方面，我們幾乎無能為力，只能期待核酸結構研究技術早日獲得突破。
核酸適配體技術從1990年建立以來經歷了近30年，那么這30年過程當中，其實篩選方法一直在進步，但也沒有突破性的進展，核酸適配體也沒有像人們想象那樣獲得廣泛的發展，整個產業依然是比較小眾，那這個背后原因，其實真正的難點在于基礎研究沒有獲得突破，導致篩選技術瓶頸沒有突破。篩選出來的東西少了，能走到產業化應用階段的就更少了。
我相信在未來的三五年，篩選技術一定會取得突破性的進展。篩選的適配體多了，有價值的也會多，能走到產業化階段的也會多起來。產業生態才會慢慢建立，形成一個生態圈。我相信在未來3到5年之內，篩選技術篩選方法還會有很多新的技術建立起來，特別是高通量鑒定的方法，快速鑒定的方法。
其實篩選方法研究和結構功能研究，是相輔相成的。篩選到大量的適配體，有助于我們研究結構與功能，也可以讓我們更好地理解結構與功能的關系。結構功能關系搞清楚了，可以更好地指導我們改進篩選方法。所以，這兩者其實是一個相互促進的關系。
對于我們來說，我們比較擅長的還是做篩選技術研究，我們無法去做結構研究，所以我們會盡量提升篩選的成功率，建立高效的篩選方法，盡可能獲得更多的優質的適配體。
簡單總結一下，就是核酸適配體篩選困難，雖然它本身的技術并不復雜，難點是在于我們對整個核酸適配體缺少一些了解，而對它缺少了解，原因是基礎研究的缺乏，基礎研究的缺乏又源自研究手段的欠缺。
總之，篩選，依然很難。
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