農桿菌介導的大麥轉化方法實驗
實驗材料?植物凝膠pBract 質粒pSoup 質粒
試劑、試劑盒?利福平卡那霉素
儀器、耗材?MG L 培養基
實驗步驟
1. 組織培養基的準備
提前準備好所需濃度 2 倍的植物凝膠，高壓滅菌（見注 3 ) 。所有的組織培養基都要過濾滅菌，因此除了無菌的儲備液，其他培養基成分按所需濃度 2 倍的量混勻，調到合適的 pH 后 ，過濾滅菌（使用瓶頂過濾器， 0.22 μm 微孔濾膜，Millipore) 。使用前將 2x 凝膠和 2x 培養基在水浴鍋中加熱至 60℃。將所需儲備液在無菌條件下加入到熱的培養基中，培養基和植物凝膠混合后倒入 9 cm 培養皿中（Sterilin ) 。分化培養時，將培養基倒入較深的組織培養皿中（100 mm X 20 mm， Falcon) 。
2. 根瘤農桿菌接種前的準備工作
( 1 ) 標準接種液制備采用文獻 [ 2 ] 中介紹的方法，稍作修改。
( 2 ) 挑取一個含有 pBract 質粒和 pSoup 質粒的 AGL1 農桿菌單克隆，接種于 10 ml 含 25 μg/ml 利福平和 50 μg/ml 卡那霉素的 MG/L 培養基中，于 28℃、180 r/min 振蕩培養 40 h。
( 3 ) 將 10 ml 無菌的 30% 甘油加入細菌懸浮液中，顛倒混勻數次。
( 4 ) 將 400 μl 標準接種液分裝于 0.5 ml 的離心管中，室溫放置 2 h，每 30 min 顛倒混勻一次。
( 5 ) 將標準接種液置于 -80°C 儲存。
3. 分離大麥幼胚
(1) 幼穗的收采與消毒
① 當幼胚直徑長到 1.5~2 mm 時米收麥穗 （見注 4) 。
② 在剪取麥穗之前，從每穗中間取一粒種子，檢查幼胚的大小，確保達到要求 [圖? 9.2 (a) ~(c) ] 。
③ 取下成熟種子，去芒，但不要破壞種殼。
④ 先用 70% 乙醇消毒 30s，再用無菌水沖洗 3 次。
⑤ 在次氯酸鈉（次氯酸鈉溶液，Fluka71696 ) 與水比例為 50:50 的溶液中浸泡 4 min。
⑥ 用無菌水洗滌 4 次后，將水倒掉但保持種子濕潤，置于無菌的螺口瓶中待用。
(2) 分離幼胚并移除胚軸
① 所有的操作均在無菌操作臺上進行。
② 每次大約取 20 粒消毒過的種子置于解剖鏡無菌的藍色或黑色底板上。
③ 用一只鑷子固定種子，另一只鑷子剝出幼胚，去除胚軸（見注 5 ) [圖 9. 2 ( c )~( d ) ]。
④ 幼胚盾片朝上，置于愈傷組織誘導培養基上。
⑤ 每個直徑 9 cm 的培養皿放 25 枚幼胚，準備接種農桿菌，23~24°C 暗培養。
4. 農桿菌的準備、接種與共培養
( 1 )? 將農桿菌標準接種液加入 10 ml MG/L 液體培養基中，不加抗生素，28℃ 下 180 r/min 培養過夜（大約 20 h ) 。
( 2 ) 用農桿菌培養液原液接種幼胚。
( 3 ) 用 200 μl 的移液槍將少量農桿菌滴在每個幼胚上，使其剛好覆蓋幼胚的表面。
( 4 ) 處理完一個培養皿中的 25 個幼胚后，將培養皿傾斜，使幼胚上多余的農桿菌流出。
( 5 ) 每次最多接種 2 個培養皿的幼胚，然后將幼胚小心轉移至另一個新鮮的誘導培養基上，盾片朝下。
( 6 ) 注意不要將多余的培養基或農桿菌帶入新的培養基，必要時可將幼胚輕輕地在培養基上劃動以去除多余的農桿菌再轉入新的培養基。
( 7 ) 用醫用膠帶將培養皿密封，23~24°C 培養 3 天。第一天分離幼胚、第二天接種比較方便，當然也可以在分離幼胚當天接種（見注 6) 。
5. 轉化子的篩選
( 1 ) 共培養 3 天后，將幼胚轉移至含有潮霉素和特美汀的愈傷組織誘導培養基中，潮霉素用于選擇培養，特美汀用于抑制農桿菌（見注 7) 。
( 2 ) 幼胚盾片朝下，23~24°C 黑暗培養。該步驟稱為選 1。
( 3 ) 2 周后，將胚轉移至新的選擇培養基上（選 2 ) 。同一個幼胚及其長出的愈傷組織作為一個整體進行轉移，不要分開。
( 4 ) 繼續培養 2 周后，將胚轉移至新的選擇培養基上（選 3 ) (見注 8 ) ，在這一時期，愈傷會從胚上脫落，將其放在該胚周圍并做好標記，以便追蹤來源于同一個幼胚的所有愈傷組織的生長情況。
( 5 ) 減少每皿胚的數量，因為胚來源的抗性愈傷將開始快速生長。
( 6 ) 在愈傷組織誘導培養基上選擇培養 6 周后，將愈傷組織轉移至含有潮霉素和特美汀的過渡培養基上。于 24℃、弱光下培養 2 周 ，即把培養皿放到有光照的組織培養室中，用薄紙片將培養皿蓋住以獲得較暗的光線。經過這兩周的培養之后，轉化的愈傷可明顯區分且開始出現綠色區域和小的嫩芽。未轉化的愈傷在含潮霉素的培養基上幾乎不分化。
6. 轉基因植株的再生
( 1 ) 在過渡培養基上培養 2 周后，最終將胚性組織轉移至再生培養基上，用高的培養皿，培養基不加任何生長調節劑，但含有相同濃度的潮霉素和特美汀。
( 2 ) 由于轉化的愈傷會長得非常快，需進一步減少每個培養基中的愈傷數。
( 3 ) 典型再生中的愈傷形態見圖 9.3 ( a ) 和圖 9.3 ( b ) 所示。同一幼胚來源的再生愈傷要放在一起。
( 4 ) 當幼苗的芽長至 2~3 cm，也形成根時，從培養皿中移出，轉移到含有 12 ml 愈傷組織誘導培養基的玻璃試管（Sigma C-5916) 中，該培養基不加麥草畏或其他生長調節劑，但仍需加相同濃度的潮霉素和特美汀。
( 5 ) 轉移至試管中生長的植株如圖 9.3 ( c ) 和圖 9.3 ( d ) 所示。轉基因植株在含有潮霉素的生根培養基中能很快形成強壯的根系。
( 6 )? 在含有潮霉素的培養基中能形成強壯根系的植株，往往都是轉化成功的，用這種篩選方法不會有逃逸或非轉化的植株存活下來（見注 9) 。
( 7 ) 當生根的植株長至試管頂部，便可將其轉移至土壤中。
( 8 ) 用長鑷子輕輕地將幼苗從試管中移出，根部的組織培養基用水沖洗干凈，種植于直徑 5 cm、裝有相同大麥生長介質種的盆中。
( 9 ) 幼苗可單獨用有孔的小塑料杯罩住或整盆用蓋子罩住以保持濕度，直至幼苗在土壤中定植良好。
( 10 ) 當幼苗在土壤中扎根后，就可以取葉片分析目的基因是否存在。圖 9. 4 顯示轉基因植株葉片中 gus 基因的表達情況。
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