用ETD線性離子阱質譜成功鑒定蛋白和翻譯后修飾
By Andreas Huhmer, Director of Proteomics Marketing, Thermo Fisher Scientific
????? 在翻譯后修飾和/或極堿肽的序列分析方面，電子轉移裂解（ ETD ）線性離子阱質譜是很有優勢的工具。傳統的誘導活化裂解（CAD）常用來鑒定蛋白，并試圖確定和找到他們修飾的位點，但這種技術有其本身固有的缺點，下面將詳細敘述。與線性離子阱的結合使用的ETD是蛋白質組學研究的一個可靠的技術，可以很容易鑒定用CAD不能鑒定的多肽。ETD 是一個相對較新的肽/蛋白質碎裂的技術，能夠大大推進質譜鑒定蛋白質這個領域的進步。
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翻譯后修飾
????? 翻譯后修飾（PTM）是翻譯后的蛋白質進行的一種化學修飾，是蛋白質生物合成的后續步驟之一。蛋白的分析及其翻譯后修飾的分析對于研究許多疾病是非常重要的，如癌癥、糖尿病、心血管疾病和神經退行性疾病---阿爾茨海默病。這是因為在蛋白質的合成的過程中以及合成之后，可能發生各種蛋白修飾。對于正常細胞的功能，這些修飾是必須的，但調節這些修飾的變化可能會導致疾病的發生，如阿爾茨海默病，癌癥和勃起功能障礙。蛋白質修飾可提高/降低蛋白質的活性，可以與其他蛋白質發生相互作用和將某一蛋白質定位到細胞的特定地方。
????? 翻譯后修飾，如磷酸化，乙酰化和甲基化被用作化學開關，激活/滅活組蛋白基因轉錄調控， DNA復制和DNA損傷修復。組蛋白是染色質的主要蛋白，DNA盤繞時，它們起到線軸的作用，而且在基因調控中發揮重要作用。因此，鑒定這種翻譯后修飾是必需的，因為它在生物系統中對于某些蛋白的功能和作用至關重要。
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用CAD鑒定蛋白
????? 質譜在確定蛋白及其翻譯后修飾上發揮了不可或缺的作用。CAD是一種常見的分析鑒定蛋白質的技術。一般用胰蛋白酶將蛋白質消化成較小的多肽，然后用反相色譜將其分離，并直接注入電噴霧質譜儀檢測，通過串聯質譜（ MS / MS法）獲得序列信息。通過電噴霧電離這些多肽形成幾種帶電狀態的肽離子，而較低帶電狀態的最適合CAD分析。低能量的CAD串聯質譜一直是最常用的分析方法，通過裂解肽離子進行后續的序列分析。
????? 翻譯后修飾分析，如磷酸化，磺酸化和糖基化很難用CAD進行分析，因為這些修飾通常是不穩定且容易丟失肽骨架的碎裂信息，從而導致很少或幾乎不能得到肽序列和磷酸化位點。利用常規的CAD質譜對于含多個堿性殘基多肽測序也是極為困難。
????? 根據不同的蛋白質序列，有時胰蛋白酶會產生過小或過大的肽段。在這種情況下，缺乏可信的序列分析手段。因此CAD對短的，低帶電的多肽是最有效的。對于鑒定蛋白和了解蛋白的生物學功能，這是一種廣泛使用的方法，然而，限制了研究者分析了所有的肽段，這也阻止多個翻譯后修飾位點的檢測和了解這些蛋白的生物學功能。
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先進的碎裂方式：ETD
????? ETD是基于離子/離子氣相化學一種碎裂多肽的新方法。ETD通過從陰離子自由基到質子肽轉移電子的化學能量將肽碎裂，這引起多肽骨干的分裂。 ETD產生的骨干肽序列和肽側鏈的信息往往與CAD互補。
????? ETD已成功應用與線性離子阱以及其前身三維離子阱。雖然ETD在三維阱的執行價格具有競爭力且和CAD自身相比提供了獨特好處 ，這樣的組合并沒有提供蛋白質組學分析所需的技術能力。非線性離子阱的ETD，它一直未能很好控制裂解過程，而且由于三維阱離子存儲能力的有限不能處理大量的多肽。基于此，研究人員已經提出ETD功能應用于線性離子阱（Thermo Scientific LTQ XL mass spectrometer質譜儀） 。
????? 相對于傳統的CAD技術， ETD提供了更穩定的方法來定性PTMs，鑒定大型多肽或甚至整個蛋白質。 ETD能夠將普通翻譯后修飾的多肽，或者多個堿性殘基的多肽甚至整個蛋白質生成離子。 ETD也可以輕易碎裂含有二硫鍵的的多肽。
????? ETD是為更復雜的FT-ICR儀器開發相似的裂解技術。使用電子轉移試劑，而不是影響肽碎裂的自由電子使ETD在廣泛使用的射頻四極離子阱中得到應用。射頻離子阱質譜儀具有低成本，低維護費用以及更易接受優點，相對于CAD碎裂方法，ETD碎裂技術能夠產生更多的產物離子，利于肽段的解讀。
????? ETD的線性離子阱提供了強有力的工具鑒定蛋白及其翻譯后修飾 。LTQ XL線性離子阱質譜儀比其他任何離子阱提供更多的結構信息，ETD能夠得到常規方法無法得到的序列信息。相比非線性離子阱，ETD的線性離子阱的顯著特征在于離子和離子發生反應。雖然ETD功能是完全自動的且通常無需用戶干預，但是當需要對離子數進行累積的時候，用戶可通過軟件完全控制線性離子阱的離子。線性離子阱質譜儀有能力處理大量的樣品，并分析低濃度的大分子和小分子。與非線性離子阱的相比，該過程更為復雜和費時。
帶ETD 的LTQ XL
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應用實例
????? 在最近的應用中，極堿的多肽和大量重要的翻譯后修飾已經用含CAD和ETD線性離子阱質譜分析了。通常CAD碎裂方式產生的普通只顯示有限的肽碎裂信息。然而，用ETD碎裂這些多肽的時候， 肽骨架碎裂信息能完全或幾乎完全產生，因此得到更廣泛的多肽序列的信息。
????? ETD的靈敏度和穩定性對于蛋白質組學分析是必不可少的。 ETD提供了高度可靠的解決方案，此方案具有用戶友好性，幾乎不需要日常維護，并提供高度準確的數據，而且ETD的數據分析有相應的軟件支持，非常方便簡單。
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結論：
????? 在蛋白質組學研究領域，ETD的應用對于研究疾病的機理，如癌癥，藥物開發研究以及細胞功能和信號轉導有重大意義，ETD將擴大目前的分析，包括更多的堿性、非胰酶切肽段和蛋白質。它們能確定各種翻譯后修飾以及鑒定新的蛋白亞型。
????? 配備ETD的線性離子阱質譜可應用于蛋白質組學各個領域內。ETD的線性離子阱將繼續推動蛋白質組學的發展，而且已被證明是替代CAD一種有效技術，而且ETD同樣可以應用于非線性離子阱進行肽序列分析。在不久的將來，配備ETD的線性離子阱預計將成為碎裂技術的一種新選擇。
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參考文獻
? Leann M. Mikesh et al, The utility of ETD mass spectrometry in proteomic analysis, Biochemica et Biophysica Acta (2006), doi:10.1016/j.bbapap.2006.10.003
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關于賽默飛世爾科技（Thermo Fisher Scientific）
賽默飛世爾科技有限公司（Thermo Fisher Scientific Inc.）（紐約證交所代碼：TMO）是全球科學服務領域的領導者，致力于幫助客戶使世界變得更健康、更清潔、更安全。公司年度營收達到105億美元，擁有員工34,000多人，為350,000多家客戶提供服務。這些客戶包括：醫藥和生物技術公司、醫院和臨床診斷實驗室、大學、研究院和政府機構以及環境與工業過程控制裝備制造商等。該公司借助于 Thermo Scientific 和 Fisher Scientific 這兩個主要品牌，幫助客戶解決從常規測試到復雜的研發項目中所面臨的各種分析方面的挑戰。Thermo Scientific 能夠為客戶提供一整套包括高端分析儀器、實驗室裝備、軟件、服務、耗材和試劑在內的實驗室工作流程綜合解決方案。Fisher Scientific 則提供了一系列用于衛生保健，科學研究，以及安全和教育領域的實驗室裝備、化學藥品以及其他用品和服務。賽默飛世爾科技將努力為客戶提供最為便捷的采購方案，為科研的飛速發展不斷地改進工藝技術，并提升客戶價值，幫助股東提高收益，為員工創造良好的發展空間。欲獲取更多信息，請登陸：www.thermofisher.com（英文），www.thermo.com.cn （中文）。
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