血液腫瘤的分子診斷
隨著分子生物學及其相關技術的迅速發展，血液系統腫瘤的診斷已進入“精確診斷”時代。目前血液學實驗室中主要的分子生物學平臺包括聚合酶鏈反應（ＰＣＲ）技術、測序技術和基因芯片等；這些技術具有靈敏度高、特異性強、重復性好等優點，在血液腫瘤的診斷、分型、預后判斷、療效評估、微小殘留病的監測及個體化治療等多個方面發揮了重要作用。我們簡要概述分子生物學在血液腫瘤診斷中的應用和進展。
一、急性白血病
急性白血病是一類造血干細胞在分子水平發生異常而導致的分化障礙和凋亡阻滯的異質性疾病。具有相同分子遺傳學異常的白血病在致病機制、細胞形態、免疫表型和預后等方面基本相似。融合基因主要通過染色體的易位形成，是急性白血病的一種重要致病機制，融合基因的檢測已成為急性白血病診斷和分型的重要依據。ＡＭＬ１-ＥＴＯ、ＰＭＬ-ＲＡＲα、ＣＢＦβ-ＭＹＨ１１等是急性髓系白血病（ＡＭＬ）最常見的融合基因，可據此進行診斷和分型，當患者出現以上３種重現性遺傳學異常時，即使原始細胞＜２０％，也診斷為ＡＭＬ；Ｂ系的急性淋巴細胞白血病（ＡＬＬ）中較常見的融合基因包括ＢＣＲ-ＡＢＬ、ＴＥＬ-ＡＭＬ１、Ｅ２Ａ-ＰＢＸ１、ＭＬＬ-ＡＦ４和ＭＹＣ-ＩｇＨ等；Ｔ-ＡＬＬ較常見的融合基因有ＳＩＬ-ＴＡＬ１和ＲＨＯＭ２-ＴＣＲδ等。此外，許多較罕見的融合基因也被陸續報道,如ＤＥＫ-ＣＡＮ、ＮＵＰ９８-ＨＯＸＡ９、ＮＵＰ９８-ＨＯＸＤ１３和ＧＴＦ２Ｉ-ＲＡＲＡ等。
預后危險度分層是制定治療策略的主要依據，ＦＬＴ３-ＩＴＤ、ｃ-ｋｉｔ、ＮＰＭ１和ＣＥＢＰα的突變已被常規用于對ＡＭＬ進行危險度分層。ＦＬＴ３-ＩＴＤ和ｃ-ｋｉｔ為不良預后因素，而ＮＰＭ１和雙突變的ＣＥＢＰα患者大多預后良好。除此之外，近年來發現了更多的基因如ＤＮＭＴ３Ａ、ＩＤＨ１、ＩＤＨ２、ＴＥＴ２、ＷＴ１、ＡＳＸＬ１、ＫＲＡＳ、ＮＲＡＳ、ＲＵＮＸ１和ＣＢＬ等突變，大多為ＡＭＬ預后不良的指標。涉及ＡＬＬ預后的基因有ＩＫＺＦ１、ＰＡＸ-５、ＮＯＴＣＨ１、ＦＢＸＷ７、ＣＤＫＮ２Ａ／Ｂ、ＣＲＬＦ２、ＴＰ５３、ＪＡＫ１／２、ＣＲＥＢＢＰ、ＰＨＦ６和ＣＤＫＮ１Ａ等；其中ＩＫＺＦ１突變主要見于Ｂ-ＡＬＬ，與高復發率、不良事件的發生相關；ＮＯＴＣＨ１和ＦＢＸＷ７則是Ｔ-ＡＬＬ常見的突變，二者突變常同時存在，提示預后良好。
微小殘留病（ＭＲＤ）檢測已被常規用于評價白血病的預后和療效。目前已有多種分子標志物被用于ＭＲＤ水平檢測，包括ＲＵＮＸ１、ＷＴ１、ＮＰＭ１等。
二、骨髓增殖性腫瘤（ＭＰＮ）
作為人類發現的第一個融合基因，ＢＣＲ-ＡＢＬ是確診慢性粒細胞性白血病（ＣＭＬ）的主要依據。定期監測ＢＣＲ-ＡＢＬ的表達水平，可準確評估其療效及預后判定。酪氨酸激酶抑制劑（ＴＫＩ）的使用是腫瘤個性化治療的里程碑，而ＡＢＬ激酶區突變則是ＴＫＩ治療失敗的重要原因，及時檢測ＡＢＬ激酶區突變，有助于選擇相應的治療方案。
ＷＨＯ２００８造血與淋巴組織腫瘤分類中將ＭＰＮ分為８類，其中真性紅細胞增多癥（ＰＶ）、原發性血小板增多癥（ＥＴ）和原發性骨髓纖維化（ＰＭＦ）合稱為經典ＭＰＮ，長期以來經典ＭＰＮ的診斷主要依賴于骨髓病理的檢查。２００５年ＪＡＫ２／Ｖ６１７Ｆ突變的發現，使得ＭＰＮ的診斷取得突破性的進展，尤其是在ＰＶ中的高頻率；隨后報道的ＪＡＫ２ Ｅｘｏｎ１２及ＭＰＬ Ｅｘｏｎ１０的突變進一步擴充了ＭＰＮ的分子指標，但是仍有４０％～５０％的ＥＴ和ＰＭＦ患者缺乏特異性的分子標志物。２０１３年對ＣＡＬＲ基因突變的研究表明，除少數ＭＤＳ患者外，ＣＡＬＲ基因突變主要見于ＭＰＮ，聯合檢測ＪＡＫ２、ＭＰＬ、ＣＡＬＲ基因突變，在ＭＰＮ患者中的陽性率可達９０％以上。與ＪＡＫ２突變的患者相比，ＣＡＬＲ突變的ＥＴ和ＰＭＦ患者表現出較低白細胞計數、較高的血小板計數、以及更好的總生存率。ＣＡＬＲ突變的檢測進一步提高了ＭＰＮ的診斷水平。
另外一項研究為慢性中性粒細胞白血病（ＣＮＬ）的診斷及治療帶來重大突破。研究人員發現２７例ＣＮＬ或不典型ＣＭＬ患者中，有１６例患者（５９％）存在ＣＳＦ３Ｒ突變，而該突變在其他研究對象中的檢出率不到１％，表明這些ＣＳＦ３Ｒ突變為這兩種疾病所特有。ＣＳＦ３Ｒ突變包括截斷突變和近膜突變兩種，分別對多激酶抑制劑Ｄａｓａｔｉｎｉｂ和ＪＡＫ家族激酶的抑制劑魯索替尼敏感。鑒于ＣＡＬＲ及ＣＳＦ３Ｒ在ＭＰＮ亞型診斷中的高度特異性，Ｔｅｆｆｅｒｉ等建議新的ＷＨＯ分類系統中將二者的檢測納入ＭＰＮ的診斷標準中。
三、骨髓增生異常綜合征（ＭＤＳ）
ＭＤＳ的發生和演變是一個累及多基因的多步驟的病理過程，目前發現的參與ＭＤＳ發生發展的基因突變主要包括：（１）表觀遺傳調節子基因，如ＴＥＴ２、ＡＳＸＬ１、ＤＮＭＴ３Ａ、ＥＺＨ２、ＩＤＨ１、ＩＤＨ２和ＡＴＲＸ等；（２）剪接體復合物蛋白編碼基因，如ＳＦ３Ｂ１、ＳＲＳＦ２、Ｕ２ＡＦ１和ＺＲＳＲ２等；（３）信號轉導相關基因及轉錄因子編碼基因，如ＫＲＡＳ、ＮＲＡＳ、ＲＵＮＸ１、ＪＡＫ２和ＣＥＢＰα等；（４）其他，如ＴＰ５３、ＮＰＭ１等。其中ＡＳＸＬ１、ＥＺＨ２、ＲＵＮＸ１、ＴＰ５３、ＳＲＳＦ２和ＺＲＳＲ２被認為是預后不良基因。ＳＦ３Ｂ１突變是難治性貧血伴有環形鐵粒幼細胞（ＲＡＲＳ）的主要致病基因，突變率高達８４.８％，伴有該突變的患者預后較好；ＴＥＴ２突變最早在ＭＤＳ中發現，且是ＭＤＳ中突變率較高的基因，目前ＴＥＴ２突變對ＭＤＳ預后的影響尚有爭議，有待于通過大量的病例進一步驗證。
四、淋巴瘤
淋巴瘤是病理診斷中的一個難點，部分病例表現復雜，單純通過形態學和免疫表型很難準確鑒別，而一些特異性的遺傳和分子水平的改變則可幫助診斷及進一步分型。淋巴瘤的形成是由于淋巴細胞成熟阻滯于某個階段發生克隆性增生，因此全部腫瘤細胞具有一個相同的免疫球蛋白（Ｉｇ）或Ｔ細胞受體（ＴＣＲ）基因重排，即單克隆性重排。需要注意的是，克隆性的增生并不一定就是淋巴瘤，當患者存在免疫缺陷（先天性、移植后、人免疫缺陷病毒感染）、自身免疫性疾病、ＥＢ病毒感染性淋巴組織增生性病變、良性單克隆性γ球蛋白病、良性皮膚Ｔ細胞增生性病變等時也可檢測到克隆性的改變。另外，Ｉｇ和ＴＣＲ基因并不局限于Ｂ和Ｔ細胞譜系，存在著譜系交叉，特別是在原始淋巴細胞性腫瘤中。ＮＫ細胞目前沒有特別理想的克隆性標志物，雖然殺傷細胞免疫球蛋白樣受體（ＫＩＲ）家族中的ＣＤ１５８ａ、ＣＤ１５８ｂ和ＣＤ１５８ｅ的限制性表達是ＮＫ細胞克隆性的標志，但和ＣＤ１５８家族的復雜性相比，目前有限的ＣＤ１５８抗體不足以用于臨床診斷。
霍奇金淋巴瘤（ＨＬ）是治愈率較高的一類腫瘤。研究證實ＨＬ中存在ＪＡＫ-ＳＴＡＴ和ＮＦ-ΚＢ信號通路的激活。全基因組測序的結果發現兩個編碼ＪＡＫ-ＳＴＡＴ信號通路調控因子的基因發生突變，分別是ＳＯＣＳ１和ＰＴＰＮ１。此前的研究已經證實ＳＯＣＳ１是ＨＬ中一個重要的腫瘤抑制基因；ＰＴＰＮ１突變見于２０％的ＨＬ患者，該基因的沉默可引起下游靶基因的過度磷酸化及過表達。這些基因的鑒定有助于進一步發現ＨＬ的特殊標志物。
根據基因表達譜的特點，彌漫性大Ｂ細胞淋巴瘤（ＤＬＢＣＬ）分為三類：生發中心Ｂ細胞樣的ＤＬＢＣＬ（ＧＣＢ-ＤＬＢＣＬ）、活化性Ｂ細胞樣ＤＬＢＣＬ（ＡＢＣ-ＤＬＢＣＬ）和原發性縱隔大Ｂ細胞淋巴瘤（ＰＭＢＬ）。相對與預后較好的ＧＣＢ-ＤＬＢＣＬ，ＡＢＣ-ＤＬＢＣＬ的一個主要特征就是基因突變（如ＣＡＲＤ１１）導致ＮＦ-κＢ信號通路的持續激活。通過全基因組測序，目前已經鑒定了許多與ＤＬＢＣＬ相關的基因，主要涉及Ｂ細胞功能（ＢＣＲ、ＮＦ-κＢ、ＮＯＴＣＨ、Ｔｏｌｌ樣受體和ＰＩ３Ｋ信號通路）、免疫調節、細胞周期／凋亡或表觀遺傳調控。ＭＹＤ８８是ＡＢＣ-ＤＬＢＣＬ中頻率最高的突變，約為３０％；ＧＣＢ-ＤＬＢＣＬ中最常見的突變基因是ＥＺＨ２。ＡＢＣ-ＤＬＢＣＬ和ＧＣＢ-ＤＬＢＣＬ共同存在的突變基因包括參與染色質甲基化的基因（如ＣＲＥＢＢＰ和ＥＰ３００）、ＭＬＬ２和ＦＯＸＯ１等。Ｌｏｖｅ等首先完成了對Ｂｕｒｋｉｔｔ淋巴瘤基因組的測序，通過與ＤＬＢＣＬ基因組比較，除了特征性的ＭＹＣ基因以外，還鑒定了７０個重現性突變基因，其中可促進細胞周期進程及增殖的ＩＤ３基因突變出現在３４％的Ｂｕｒｋｉｔｔ淋巴瘤患者中，而在ＤＬＢＣＬ中未檢測到。這一發現為Ｂｕｒｋｉｔｔ的鑒別診斷及治療提供了重要依據。
套細胞淋巴瘤（ＭＣＬ）的一個標志性改變為ｃｙｃｌｉｎ Ｄ１的易位。新近學者發現，ＭＣＬ中頻率較高的突變基因除了包括已知的ＣＣＮＤ１外，還有ＡＴＭ、ＴＰ５３、ＭＬＬ２，以及編碼抗凋亡蛋白的基因（ＢＩＲＣ３、ＴＬＲ２）和參與染色質修飾的基因（ＷＨＳＣ１、ＭＬＬ２和ＭＥＦ２Ｂ）等。在慢性淋巴細胞性白血病（ＣＬＬ）的研究中，Ｗａｎｇ等通過對ＣＬＬ進行大規模平行測序，確認了９種基因突變的出現頻率顯著增加，分別是ＴＰ５３、ＡＴＭ、ＭＹＤ８８、ＮＯＴＣＨ１、ＳＦ３Ｂ１、ＺＭＹＭ３、ＭＡＰＫ１、ＦＢＸＷ７和ＤＤＸ３Ｘ，這些新發現有助于進一步對ＣＬＬ進行分類及預后評估。
２０１１年ＢＲＡＦ Ｖ６００Ｅ突變的發現，開拓了毛細胞白血病（ＨＣＬ）診斷及靶向治療的新時代。隨后的研究證實，ＢＲＡＦ Ｖ６００Ｅ僅見于典型的ＨＣＬ，而變異型ＨＣＬ及表達ＩＧＨＶ４-３４的ＨＣＬ缺乏ＢＲＡＦＶ６００Ｅ突變；ＨＣＬ中除了ＢＲＡＦ Ｖ６００Ｅ突變外，在ＢＲＡＦ第１１外顯子上還鑒定了２個新的突變點（Ｆ４６８Ｃ和Ｄ４４９Ｅ）。因此對于ＢＲＡＦ Ｖ６００Ｅ陰性的ＨＣＬ，還應檢測ＢＲＡＦ第１１外顯子。新近有學者發現，ＭＹＤ８８ Ｌ２６５Ｐ突變廣泛存在于華氏巨球蛋白血癥（ＷＭ）患者，而在多發性骨髓瘤、邊緣區淋巴瘤及ＣＬＬ等中無表達或罕見表達。因此，ＭＹＤ８８ Ｌ２６５Ｐ成為淋巴漿淋巴瘤診斷的重要依據。
雖然外周Ｔ／ＮＫ細胞淋巴瘤的診斷和分類很大程度上依賴于免疫表型，但根據現有的免疫表型，仍有４０％～５０％的外周Ｔ細胞淋巴瘤不能被鑒別，被歸類為非特殊類型外周Ｔ細胞淋巴瘤（ＰＴＣＬ-ＮＯＳ）。Ｉｑｂａｌ等利用基因表達譜對３７２例ＰＴＣＬ患者的標本進行了分析，其中５５例ＰＴＣＬ-ＮＯＳ患者通過分子標記被重新歸類。此外，根據基因表達譜差異，還將１２１例ＰＴＣＬ-ＮＯＳ患者分為兩個亞型，其中４０例患者（３３％）高表達ＧＡＴＡ３，與預后不良高度相關；另有５９例患者（４９％）高表達ＴＢＸ２１。
盡管在血管免疫母細胞淋巴瘤（ＡＩＴＬ）患者中報道存在ＴＥＴ２、ＩＤＨ２和ＤＮＭＴ３Ａ的突變，但是這些基因突變同樣存在于其他的髓系腫瘤中，不具有特異性。全外顯子組測序的結果發現６８％的ＡＩＴＬ患者檢測到ＲＨＯＡ Ｇ１７Ｖ突變，而在Ｂ細胞惡性腫瘤及髓系腫瘤中未見該突變，提示ＲＨＯＡ可作為ＡＩＴＬ的特異性分子標記物及治療靶點。
腸病相關性Ｔ細胞淋巴瘤（ＥＡＴＬ）分為１型和２型，２型診斷比較困難，常常與１型及其他發生在腸道的ＰＴＣＬ相混淆。２０１３年Ｔａｎ等發現了一種新的分子標志物ＭＡＴＫ，在２型ＥＡＴＬ患者中高表達，從而有助于２型ＥＡＴＬ的準確診斷。
２０１２年Ｋｏｏ等的研究為ＮＫ細胞淋巴瘤的診斷和治療帶來新的希望。該研究同樣采用全外顯子組測序技術篩選出分子靶標ＪＡＫ３，后續的驗證實驗發現３５.４％患者存在ＪＡＫ３突變；同時ＪＡＫ３的突變使得ＮＫ細胞淋巴瘤的細胞系能夠在缺少必需生長因子白細胞介素（ＩＬ）-２的條件下也能生長，這意味著該突變引起了ＪＡＫ３的特異激活，使得ＪＡＫ３有望成為一種可能的藥物靶標。
隨著第二代測序的廣泛應用，必然會發現越來越多的分子標志物及治療靶點，從而使分子診斷技術在血液腫瘤診治中發揮更加重要的作用。但是如何規范化應用分子診斷技術以及相應的分子病理實驗室的質量體系的建設，依然是我們所面臨的挑戰。
