有機磷急性中毒家兔乙酰膽堿酯酶活性變化
實驗概要
了解有機磷中毒的癥狀，觀察阿托品和解磷定對有機磷中毒解救的效果及乙酰膽堿酯酶活性變化。
實驗原理
有機磷是劇毒農藥,可抑制膽堿酯酶,使體內積聚大量的乙酰膽堿,導致M、N樣癥狀;阿托品和解磷定可分別解除M樣癥狀和恢復酶的活性,可達到解救目的。
主要試劑
0.2% （V/V） DDV? (敵敵畏)
1mg/ml? Atropine sulfate solution? (硫酸阿托品溶液)
25mg/ml? Pyraloxime iodide? (碘解磷定溶液,? PAM-1)
500U/ml? Heparin N.S solution? (肝素生理鹽水溶液)
pH7.2? Phosphate buffer saline? (磷酸鹽緩沖液)
0.007M? Ach substrate application solution? (乙酰膽堿底物應用液)
Alkaline hydroxylamine solution? (堿性羥胺溶液)
33.3％（V/V） Hydrochloric acid solution? (鹽酸溶液)
10%?? Trichloride ferric solution （三氯化鐵溶液）
N.S? (Normal saline, 生理鹽水)
主要設備
恒溫水浴? 家兔固定箱? 1ml、2ml、5ml、10ml注射器 10ml試管試管架? 漏斗? 濾紙? 嬰兒秤? 5ml加樣器? 1ml加樣器? 200ul加樣器? 100ul加樣器
實驗材料
動物： 家兔(2.5kg左右)
實驗步驟
1. 取家兔2只,編號（甲、乙）稱重,觀察下列生理指標并分別紀錄：活動情況、呼吸、瞳孔大小、唾液分泌、大小便、肌張力及有無震顫等。
2. 將家兔分別固定于兔固定箱中，用500U/ml肝素（或10％草酸鈉）濕潤過的注射器由耳緣靜脈每兔抽血0.5ml ,作為用藥前血樣。然后各兔均由耳緣靜脈注入0.2％敵敵畏0.1ml/kg。密切注意上述各項生理指標的變化。
3．當中毒癥狀明顯時，按前法每兔取血0.5ml，為農藥中毒血樣。繼而立即給甲兔iv ?1mg/ml? Atropine sulfate solution 2ml/kg; 乙兔iv 25 mg/ml的PAM-1 ?，劑量為2ml/kg。給藥過程中和給藥后密切觀察各項生理指標的變化，注意各兔的區別和給藥后好轉的時間（觀察結果填入表1）
?表1? 家兔各項生理指標的變化
兔號 | 體重 | 觀察時間 | 活動情況 | 呼吸情況 | 瞳孔大小 | 唾液分泌 | 大小便情況 | 肌張力大小 | 肌震顫程度 | 給藥后好轉的時間 |
? 甲 | 給DDV前 | |||||||||
給DDV后 | ||||||||||
給atropine后 | ||||||||||
? 乙 | 給DDV前 | |||||||||
給DDV后 | ||||||||||
給PAM-1后 |
?
4. 待中毒癥狀明顯消失后20分鐘，再以同樣法取血0.5ml，為治療后血樣。
5. 取上述三次待測血液樣本，每一份血樣都要分標準管、測定管和空白管，測定方法均按下表所示操作步驟進行。操作時，每加一種試劑均需充分搖勻，并嚴格控制保溫時間。
表 2?? 全 血 膽 堿 酯 酶 測 定 操 作 步 驟
步?????????????????????? 驟 | 標 準 管 （ml） | 測 定 管 ?? (ml )?? | 空 白 管 (ml ) |
（1）pH7.2磷酸鹽緩沖液 | 1.0 | 1.0 | 1.0 |
（2）全血 | 0.1 | 0.1 | 0.1 |
（3）37℃ | 水?? 浴?? 預?? 熱?? 3?? 分?? 鐘 | ||
（4）乙酰膽堿底物應用液 | 1.0 | ||
（5）37℃ | 水?? 浴?? 保?? 溫?? 20?? 分?? 鐘 | ||
（6）堿性羥胺溶液 | 4.0 | 4.0 | 4.0 |
（7）乙酰膽堿底物應用液 | 1.0 | ||
（8）室溫 | 靜??? 置??? 2??? 分?? 鐘 | ||
（9）33.3％（V/V）鹽酸溶液 | 2.0 | 2.0 | 2.0 |
（10）10%三氯化鐵溶液 | 2.0 | 2.0 | 2.0 |
???? 混勻2分鐘后，分別過濾，于20分鐘內，用酶標儀測定（選波長492nm），讀取各管光密度。 | |||
?膽堿酯酶活力單位計算公式：
???? ????????????????????標準管光密度－測定管光密度
膽堿酯酶活力（單位/ml）＝—————————————— ×70
--???????????????????????? 標準管光密度－空白管光密度
以1ml血液在規定條件下能分解1μM乙酰膽堿的膽堿酯酶活力稱為1個膽堿酯酶活力單位。式中“70”是由于每管中加有7μM乙酰膽堿，0.1ml血液，即7×1.0/0.1=70
?
注意事項
1.氯化乙酰膽堿在空氣中易潮解，故需用具蓋稱量瓶盡快稱好。
2.水浴溫度和保溫時間都能影響酶的反應，因此必須嚴格控制。
3.加三氯化鐵溶液顯色后，棕紅色鐵絡合物易退色，故應在20分鐘內比色完畢。如有大批樣品需要分析，可分批加三氯化鐵溶液。
4．若乙兔中毒癥狀嚴重，給PAM-1后應靜脈注射阿托品1ml/kg。
