5分鐘了解活細胞成像：記錄真實過程 揭示生命真相
對人類活動的記錄促使了抖音等視頻的流行，對科學的觀察和記錄也有同樣的追求，正在從靜態的“快照”觀察轉向對活體動態過程的描述。目前研究活性物質生物活性的最有效手段正是活細胞成像，它徹底革新了生物學家研究細胞、蛋白質以及眾多分子之間相互作用和生理過程的方式，活細胞成像市場正在吸引著大量公司的進入，預計2025年將達到280億美元。本文將介紹活細胞成像的市場和主要技術，并在下篇介紹近幾年推出的主要產品，希望為您下次入囊前提供參考。
市場概要
活細胞成像使用延時顯微鏡對活細胞的深入研究，首次引入用于顯示海膽卵的受精和發育。它是生物醫學研究學科和實驗室研究的重要分析工具，如神經生物學，發育生物學，藥理學和細胞生物學。它是獲得圖像質量和維持健康細胞之間的折衷，在生命科學研究實驗室中起著至關重要的作用，通過研究細胞行為和途徑，更深入地了解疾病機制、功能和對治療的反應，并從細胞的珍貴樣本中獲得最大信息。此外，生物學研究越來越關注動態過程，如細胞內運輸，遷移和細胞發育。由于已經開發了幾種顯微鏡方法來以更少的努力和更詳細的方式研究活細胞，研究人員可以比任何其他方法更有效地理解活細胞的性質，比如一種更穩定的、利用量子點的新型成像。成像技術的不斷進步和熒光探針的設計提高了活細胞成像的能力，并成為生物學中的重要工具。
在生物學研究中，當前對更可靠、更相關的活細胞的需求比固定細胞顯微鏡的需求更大；一些成像系統還能夠維持活體動物體內的分子。活細胞成像在預測組織、模型生物、小動物發育和結構研究的3D成像方面的應用越來越多，這將在未來推動全球活細胞成像市場的發展。活細胞成像正在成為許多生命科學和生物醫學研究領域的必要技術，如細胞生物學、發育生物學、癌癥生物學和藥物發現。
全球活細胞成像市場規模預計將從 2020 年的 180 億美元增長到 2025 年達到 280 億美元，在預測期內以 8.8% 的復合年增長率增長。
來源：marketsandmarkets網站
驅動活細胞成像市場增長的主要動力來自于：藥物發現中越來越多地采用高內涵篩選技術，以及癌癥發病率的上升；政府投入和研究資金的增長，細胞生物學應用范圍的不斷擴大；對再生醫學研究的投資。然而，高內涵篩選系統具有較高成本是限制增長的因素。
主要技術
活細胞成像市場的技術部分分為延時顯微鏡、光漂白后的熒光恢復（FRAP）、高內涵篩選、熒光共振能量轉移（FRET）、熒光原位雜交等。
活細胞成像技術用于通過管形成試驗研究血管生成，在趨化性試驗或傷口愈合試驗中研究細胞遷移，測量細胞隨時間的增殖，并使用特異性熒光染色高分辨率顯微鏡分析細胞間和細胞內信號傳導。活細胞成像是制藥行業和細胞生物學實驗室的基礎研究工具，可幫助定位藥物靶點，研究與疾病有關的分子機制。活細胞成像技術在癌癥研究中得到了廣泛應用，使研究人員能夠更容易地研究癌細胞與其環境之間復雜且往往鮮為人知的相互作用，并在藥物開發階段篩選新藥的毒性作用。此外，該過程還可以用于監測活體動物中的分子，對生物研究人員有巨大的好處。它可以最大限度地減少免疫染色和細胞固定等其他成像技術產生的偽影，并生成其他生化方法無法獲得的定性和定量數據，從而促進全球醫療市場的需求。然而，其較高的實施成本限制了其市場應用。
市場動態
推動因素：藥物發現中高內涵篩選技術的引進擴大
傳統的毒性和藥物安全性研究方法涉及通過高通量篩選對大型文庫進行篩選，這種方法價格昂貴、成功率低，并耗費大量資源和時間。為了克服這些挑戰，制藥公司越來越多地采用高內涵篩選（HCS）技術，基于細胞的測定來識別藥物開發研究中毒性的影響（基于細胞成像可以監測藥物毒性機制，如氧化應激，微核，線粒體功能障礙，脂肪變性和細胞凋亡）。HCS的使用使藥物開發過程更具時間和成本效益。在預測期內推動市場增長的主要因素包括：對毒性研究的高內涵篩選，活細胞成像在HCS中用于識別來自體外、體內和離體系統等復雜系統的有意義信息。由于遺傳靶向肽的增加，熒光共振能量轉移技術的市場也將顯著增長。
制約因素：高內涵篩選系統的高成本
高內涵篩選（HCS）儀器配備了先進的特性和功能，因此價格昂貴。學術研究實驗室預算有限、很難負擔；主要的買家是制藥公司，由于它們需要多套HCS系統，高昂的儀器價格也是其關注的問題；而且維護成本和其他一些間接費用還增加了這些儀器的總體擁有成本。這是限制活細胞成像儀器在臨床和研究應用中采用的主要因素之一，特別是在新興國家。
機遇：新興市場尚未開發的潛力
巴西、俄羅斯、印度和中國等新興市場預計將為活細胞成像市場的增長提供重要的機會，這主要歸因于這些國家各種研究機構的研發資金不斷增加。目前，中國約占全球研發支出的20%，是僅次于美國的全球第二大研發投資國；預計到2023年，中國的研發支出將超過美國。中國市場的驅動力是：臨床前活動追求節約成本和符合法規，生命科學研究的資金和投資不斷增加，高技能人才的可用性，有利的監管環境，中國有許多CRO為跨國制藥公司提供臨床前和臨床研究服務，預計未來幾年中國臨床前/臨床研究的增長將增加中國對活細胞成像的需求。
挑戰：在細胞培養物中維持細胞活力和細胞環境
成功運行活細胞成像實驗可能是一個重大挑戰，在顯微鏡下維持細胞的條件決定了實驗的成功或失敗，在載玻片上維持活細胞是實驗中最關鍵的部分。實驗中使用的細胞應處于良好狀態，并在存在合成熒光團或熒光蛋白的顯微鏡下正常運作。此外，在實驗過程中保持恒定的細胞環境非常重要。細胞應在二氧化碳培養箱的培養基中生長，溫度在維持培養物中的細胞活力方面也起著至關重要的作用。由于細胞活力和細胞環境取決于幾個特定的要求，因此活細胞成像實驗失敗的可能性很高。
市場細分
活細胞成像市場的應用領域分為細胞生物學、干細胞、發育生物學和藥物發現。基于最終用戶，活細胞成像市場分為制藥和生物技術公司，學術和研究機構，合同研究組織（CRO）。制藥和生物技術公司占市場最大份額，主要歸因于不斷增長的研發活動和各種重磅藥物的ZL壁壘。
基于產品和服務，全球活細胞成像市場分為儀器，消耗品，軟件和服務。儀器可分為顯微鏡、獨立系統、細胞分析儀和配件；消耗品市場分為試劑、分析試劑盒、培養基和其他消耗品。儀器增長最快，消耗品也將顯著增長。
從地理上講，全球活細胞成像市場分為北美，歐洲，亞太地區，南美以及中東和非洲。預測期內北美占據活細胞成像市場最大份額，主要來源于政府對生命科學研究的資助增加。亞太地區具有最高的增長率，主要歸因于政府對干細胞治療研究的舉措，再生醫學研究的日益突出，中國臨床前/臨床研究的增長，印度制藥業外國直接投資（FDI）法規的有利變化，韓國制藥和生物制藥部門的增長等因素。
該市場的主要參與者包括丹納赫的美谷分子和徠卡（美國），卡爾蔡司（德國），尼康（日本），奧林巴斯（日本），珀金埃爾默（美國），布魯克（美國），賽默飛世爾科技（美國），賽多利斯/ Essen（德國），牛津儀器（英國），安捷倫/BioTek儀器（美國），Etaluma（美國），CytoSMART （荷蘭），NanoEnTek（韓國），Phase Focus（英國）， Tomocube（韓國）、Phase Holographic Imaging PHI AB（瑞典）、BD Biosciences（美國）、Sony Biotechnology（美國）、Merck KGaA（德國）、KEYENCE（日本）、ibidi（德國）、Bio-Rad（美國）、Logos Biosystems（韓國），Nanolive SA（瑞士），ATTO公司， Enzo Life Sciences，Petaluma。
成像技術
活細胞成像技術徹底革新了生物學家研究細胞、蛋白質以及眾多分子之間相互作用和生理過程的方式。這項技術使得科學家們可以實時或者在一段時間內觀察細胞內部結構和細胞生理過程。了解這些細胞結構和動態過程對于解釋許多細胞生物學問題是至關重要的。相關技術可見下表。
表1 一些常見的活細胞成像實驗方法及其縮寫
| 實驗需求 | 方法 | 名稱縮寫 |
| 觀測分子在細胞內，以及細胞之間（通過縫隙連接）的運動 | 漂白后熒光恢復 | FRAP |
| 離子濃度（鈣、鎂）的時間或空間變化 | 離子成像 | - |
| 細胞內鈣離子濃度的定量 | 比例法離子成像 | - |
| 生物傳感 | 熒光共振能量轉移 | FRET |
| 觀測發生在細胞膜上或者附近的事件，或者對薄切片成像 | 全內反射顯微成像 | TIRF |
| 對細胞進行長期成像 | 時域熒光壽命顯微成像 | TD-FLIM |
| 觀測某個分子隨著時間的擴散情況 | 單分子示蹤-熒光相關譜 | SMT-FSC |
| 單分子的精確分辨 | 超分辨光學成像 | - |
漂白后熒光恢復（FRAP）
活細胞成像通常被用來觀測細胞內的分子運動，已有多項顯微成像技術能夠實現這一目標，如漂白后熒光恢復（Fluorescence Recovery After Photobleaching，FRAP）。在進行FRAP實驗時，需要使用高強度的光將亞細胞區域光漂白，然后檢測熒光隨時間恢復的情況，根據其恢復速度可以計算出膜蛋白或膜脂質的擴散速率。熒光恢復的速率取決于熒光分子擴散或者主動運輸到漂白區域的數量。下圖展示了一常規的FRAP的例子。FRAP還可以用來研究分子通過縫隙連接的運動過程。漂白后熒光損失實驗（Fluorescence loss in photobleaching，FLIP）和漂白后熒光恢復實驗類似，但是漂白區域是被持續的漂白。
FRAP圖例
熒光能量共振轉移（FRET）
熒光能量共振轉移（Fluorescence Resonance Energy Transfer ，FRET）是較早發展起來的一門技術，隨著綠色熒光蛋白應用技術的發展，FRET已經成為檢測活體中生物大分子納米級距離和納米級距離變化的有力工具，在生物大分子相互作用分析、細胞生理研究、免疫分析等方面有著廣泛的應用。FRET是距離很近的兩個熒光分子間產生的一種能量轉移現象。當供體熒光分子的發射光譜與受體熒光分子的吸收光譜重疊，并且兩個分子的距離在10nm范圍以內時，就會發生一種非放射性的能量轉移，即FRET現象，使得供體的熒光強度比它單獨存在時要低的多（熒光猝滅），而受體發射的熒光卻大大增強（敏化熒光）。
FRET原理
時差顯微鏡（TLM）
時差顯微鏡（Time-Lapse Microscopy，TLM）可以被描述為顯微鏡中的一種延時攝影。在這里，電影幀的捕獲頻率低于用于播放序列的頻率，這使得當序列以正常速度播放時，時間似乎移動得更快和流逝。因此，這種技術是一種時間操縱，其中可能需要幾分鐘或幾小時的現實生活事件在幾秒鐘內被觀察到完成。
TLM圖例
高內涵篩選（HCS）
高內涵篩選（High Content Screening，HCS）是指在保持細胞結構和功能完整性的前提下，同時檢測被篩樣品對細胞形態、生長、分化、遷移、凋亡、代謝途徑及信號轉導各個環節的影響，在單一實驗中獲取大量相關信息，確定其生物活性和潛在毒性。從技術層面而言，高內涵篩選是一種應用高分辨率的熒光數碼影像系統，在細胞水平上檢測多個指標的多元化、功能性篩選技術，旨在獲得被篩樣品對細胞產生的多維立體和實時快速的生物效應信息，也使在細胞水平全面評價活性化合物的成藥性成為可能，在新藥研發中發揮越來越重要的作用。
HCS圖例
熒光原位雜交（FISH）
熒光原位雜交（Fluorescence In Situ Hybridization，FISH）是20世紀80年代末在放射性原位雜交技術基礎上發展起來的一種非放射性分子生物學和細胞遺傳學結合的新技術，是以熒光標記取代同位素標記而形成的一種新的原位雜交方法。原理是利用報告分子（如生物素、地高辛等）標記核酸探針，然后將探針與染色體或DNA纖維切片上的靶DNA雜交，若兩者同源互補，即可形成靶DNA與核酸探針的雜交體。此時可利用該報告分子與熒光素標記的特異親和素之間的免疫化學反應，經熒光檢測體系在鏡下對待DNA進行定性、定量或相對定位分析。
FISH原理
離子成像
傳統的寬場熒光顯微鏡由于光散射的影響，只能夠對大腦淺層的神經元或在離體組織上進行成像，共聚焦顯微鏡由于光損傷較大，一般也只用于離體鈣成像。隨著熒光顯微鏡技術的迅速發展，在體鈣成像技術得到了蓬勃發展。雙光子熒光顯微鏡能夠在進行活體成像的時候實現高分辨率和高信噪比。例如，用雙光子顯微鏡對海馬樹突棘的鈣離子信號進行成像，研究神經元突觸后長時程抑制。
雙光子鈣成像
考慮到部分內容重疊，常規光學顯微鏡，以及依賴于熒光分子的熒光顯微鏡、全內反射顯微成像（TIRF）、時域熒光壽命顯微成像（TD-FLIM）、單分子示蹤-熒光相關譜（SMT-FSC）、超分辨光學成像，不再贅述。
應用
活細胞成像系統，包括先進的顯微鏡系統，可幫助研究人員觀察細胞分子水平、行為學變化，其中高內涵篩選對于蛋白功能、藥物開發具有重要意義。
分子水平觀察
基于熒光蛋白、探針方法，活細胞成像技術可檢測微觀指標大大增加，包括蛋白質、化合物、離子通道等方面。FRAP記錄漂白后的熒光信號強度和信號恢復，動態觀察蛋白質變化，可以應用于任何熒光標記的蛋白質，以及膜結合蛋白質、膜流動性。FRET技術在活細胞生理條件下無損傷的研究蛋白質-蛋白質間相互作用。FISH技術具有快速、檢測信號強、雜交特異性高和可以多重染色等特點，目前這項技術已經廣泛應用于動植物基因組結構研究、人類產前診斷、腫瘤遺傳學、白血病分型，實現了臨床有效應用。
FRET觀測細胞內hEAG1-Cerulean與CaM鈣依賴的相互作用
細胞行為學觀察
外界信號和細胞的固有特征會影響細胞的行為，使其參與形態的構建和進一步的分化。這些行為主要包括定向分裂(directed mitosis)、差別生長(differential growth)、細胞凋亡(apoptosis)、細胞遷移(migration)、區別粘附(differential adhesion)等
TLM觀察細胞遷徙
來源：Fan C, . J Cell Biol. 2022,221(4):e202109168.
高內涵篩選
在保持細胞結構和功能完整性的前提下，不僅能同時檢測被篩樣品對細胞的形態、生長、周期、分化、遷移、凋亡、代謝途徑及信號傳導等方面的影響，而且能檢測到靶點激活、蛋白相互作用等信息，能在單一實驗中獲取大量與基因、蛋白質及其他細胞成分相關的信息，從而實時快速地對樣品進行多角度的分析。在小分子篩選中，目標是識別一組導致表型變化的小分子。據報道，許多基于基因表達、RNAi和小分子篩選的HCS應用都采用了自動圖像分析，并且在制藥和生物技術行業中開展了更多的研究。
高內涵篩選
正所謂“磨刀不誤砍柴工”，活細胞成像檢測技術的發展極大促進了生命科學領域的突破。在COVID-19爆發的最前沿，世界各地的許多研究人員都在從事導致COVID-19的病毒SARS-CoV-2的病毒研究。生物醫學研究需要分析大量數據來開發疫苗。因此，主要的活細胞成像系統供應商，例如Leica Microsystems（德國）和CytoSMART Technologies（荷蘭），都捐贈了活細胞成像系統來協助COVID-19研究人員。
在下篇文章中，我們將匯總近年來國內外市場主流活細胞分析產品，為科研和采購人員提供借鑒和參考。
參考資料：
https://www.databridgemarketresearch.com/reports/global-live-cell-imaging-market?
https://mordorintelligence.com/industry-reports/live-cell-imaging-market?
https://www.marketsandmarkets.com/Market-Reports/live-cell-imaging-market-163914483.html?
