魚類胰彈性蛋白酶的研究進展
胰液中含有三種肽鏈內切酶，分別是胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和彈性蛋白酶。彈性蛋白酶屬于絲氨酸蛋白酶家族，是一種消化酶，在魚類食物蛋白質的消化過程中承擔著重要的生理功能。彈性蛋白酶以水解不溶性彈性硬蛋白（Elastin）為特征，專一性裂解丙氨酸、甘氨酸、絲氨酸等小的中性氨基酸殘基羧基側鏈與其他氨基酸的氨基所形成的肽鍵，具有廣泛的水解蛋白活性。?
彈性蛋白酶主要存在于動物胰臟，在皮膚、主動脈、血小板、白血球中也有存在。魚類胰彈性蛋白酶主要來源于肝胰臟、腸道和幽門盲囊。結構上，彈性蛋白酶原與胰凝乳蛋白酶原等胰絲氨酸蛋白酶相似，均具有一條信號肽、一條激活肽和一條成熟肽，功能蛋白通過信號肽形成。胰彈性蛋白酶的激活與失活都受胰蛋白酶調節，彈性蛋白酶原在胰腺中合成，并以非活性的酶原形式分泌到消化道中，在消化道中酶原被胰蛋白酶從肽鏈N端斷開肽鍵，失去一段短肽，分子構象發生一定改變后轉變為有活性的彈性蛋白酶。本文綜述國內外魚類胰彈性蛋白酶分離純化、特性研究、氨基酸組成以及序列分析等方面的研究工作，進一步闡明魚類消化生理機制，為水產飼料的配制研究提供科學的理論依據。?
1魚類胰彈性蛋白酶的分離純化研究?
科學家已經成功分離出了許多哺乳動物的胰彈性蛋白酶，例如豬、鼠及人類，并在此基礎上開展了大量研究工作。有關魚類胰腺絲氨酸蛋白消化酶的研究也有報道，但有關魚類彈性蛋白酶的研究不多，而且國外要比國內開展得早且深入。已有研究報道了非洲肺魚、鯉魚、鯰魚、鱈魚、金槍魚、虹鱒魚、角鯊、大西洋鮭胰彈性蛋白酶純化和鑒定工作。國內外魚類胰彈性蛋白酶分離純化工作，主要集中在海水魚類，少有淡水魚類。?
胰彈性蛋白酶的分離純化遵循蛋白質分離純化的一般原則。總純化程序可以分為三步：組織樣品前處理、粗分級分離和細分級分離，主要是利用蛋白質之間特異性的差異進行分離，如分子的大小、形狀、酸堿性、溶解性、溶解度、極性、電荷和與其他分子的親和性等。常用的分離純化方法和技術有：沉淀法（鹽分級沉淀、有機溶劑沉淀等）、離心、透析、層析法等等。粗分級分離是用鹽析和離心等簡單的分離方式獲得粗品，后期細分級分離獲得純品時偏向于用層析法，其中較為經典的方法為凝膠過濾層析法，離子交換層析法和親和層析法。通過凝膠過濾層析可脫去鹽等小分子雜質。離子交換層析一般是進行陰離子交換，因為魚類胰彈性蛋白酶在中性及堿性溶液中一般以陰離子形式存在。親和層析一般采用胰彈性蛋白酶抑制劑作為親和配體，主要采用親和層析，填料為Sepharose-4B。如Gunnar I.Berlund等從大西洋鮭魚幽門盲囊組織中純化彈性蛋白酶的過程為：用p-aminobenzamidine-Sepharose -6B層析柱去除粗提取液胰蛋白酶，超濾膜濃縮流出液后過phenyl- Sepharose-6 FF層析柱、過Q-Sepharose FF離子交換柱、過SP-Sepharose FF離子交換柱、過銅離子螯合柱去除胰凝乳蛋白酶、最后過Superdex 75凝膠過濾層析柱，完成最后一步精細純化獲得蛋白酶純品。?
2魚類胰彈性蛋白酶的特性研究?
在國內，江信紅等從黃鱔腸道分離純化出三種具有彈性蛋白酶活性的同工酶。謝一榮等研究了魚類彈性蛋白酶等主要消化酶在組織器官中的分布。在國外，有關彈性蛋白酶的研究較國內多且深入。Gildberg A等（1990）分離純化北大西洋鱈魚的胰彈性蛋白酶，并就底物特異性、催化效率和穩定性與豬的胰彈性蛋白酶做了比較研究。Smine A等（1995）從角鯊胰提取物中純化鑒定了胰彈性蛋白酶的兩種亞型，EI和EII。兩種酶在37℃均對彈性蛋白酶特異性高敏感底物琥珀酰（丙氨酸）3對硝基苯胺（Suc-AAA-pNA）表現出高度的催化活性，但卻具有不同的催化參數。Berglund GI等（1998）從北大西洋鮭魚的幽門盲囊純化鑒定了胰彈性蛋白酶，對該酶的生物學特性和動力學特性做了深入研究，同時與豬的胰彈性蛋白酶性質做了比較。Ulitina NN等（2005）首次從歐洲鲇魚中分離純化了三種絲氨酸蛋白消化酶，包括三種胰蛋白酶的亞型，三種胰凝乳蛋白酶的亞型和兩種彈性蛋白酶的亞型。Sakharov IIu等利用離子交換層析法和凝膠過濾層析法從中國鱟的肝胰腺純化出對特異底物Boc-（Ala）3-pNA具有高度催化活性的彈性蛋白酶，這也是最早有關從甲殼動物中分離純化出彈性蛋白酶的研究報道。?
2.1pH值和溫度對胰彈性蛋白酶的影響?
據國內外學者的研究，魚類胰彈性蛋白酶一般在pH值為5.0～9.0的條件下非常穩定。pH值對彈性蛋白酶活力的影響可通過水解琥珀酰（丙氨酸）3對硝基苯胺（Suc-AAA-pNA）的催化效率來測定。將魚類和豬的胰彈性蛋白酶做比較，科研人員發現兩種酶均在較廣的pH值范圍內保持了催化能力，但是魚類耐受酸的能力較差。有個別種屬表現出突出的酸堿耐受能力，如北大西洋鮭魚在pH值為4.0～11.0的條件下仍具有較高的催化活性。大部分魚類彈性蛋白酶在pH值低于4.0的酸性條件下變得不穩定，有個別種在pH值低于7.0時穩定性降低，如大西洋鮭魚的最適pH值在為8.0～9.5，當pH值<4.0時酶活性明顯降低，可見魚類胰彈性蛋白酶大都呈中性或弱堿性。同屬不同種的魚類的酶適宜pH值有時也存在明顯差異，就是同一種魚的酶活性在不同的pH值條件下也會有所差異，pH值是影響消化酶活性的關鍵因素之一。?
溫度是影響酶促反應的重要因素，溫度的變化影響酶活力。魚類生活環境的差異即所在環境溫度的變化，對酶的活力也相應地發生影響。一般而言，魚類消化酶活力的最適溫度均高于其所處的環境溫度。魚類胰彈性蛋白酶的最適反應溫度在30～60℃范圍內，這與大多數消化酶適宜的溫度范圍相一致，如鱈魚彈性蛋白酶在45℃反應溫度下針對Suc-AAA-pN表現出最高催化效率，但是彈性蛋白酶穩定溫度范圍與其最適反應溫度是不同的，為了研究酶對溫度（22～75℃）的耐受力，將鮭魚和哺乳動物的彈性蛋白酶分別在一定的pH值（2.0～10.5）條件下溫浴10分鐘，隨即在冰上冷卻，然后在pH值為2.0和22℃條件下用人工底物測殘留酶活力，發現鮭魚彈性蛋白酶在所有上述pH值條件下，活性較哺乳動物彈性蛋白酶低；兩種酶在中性和堿性條件下均比酸性條件下對溫度的耐受力要高。?
2.2胰彈性蛋白酶底物專一性和動力學參數及比較研究?
底物濃度對胰彈性蛋白酶水解速度的影響可用米氏常數（Km）來表示。它是酶的特征性常數，Km值越小，酶與底物的親和力越大。將來自于鼠、豬、鮭魚的胰彈性蛋白酶做比較，水解一系列人工底物Suc-AAPX-pNA（X=a-氨基酸）。結果表明，魚類彈性蛋白酶針對P1位置表現出亮氨酸、丙氨酸、纈氨酸等氨基酸偏好性。將來自于鮭魚、鱈魚、虹鱒魚、金槍魚、豬、鼠的胰彈性蛋白酶做比較，水解人工底物Suc-AAA-pNA，其中Km值（mM）分別為1.47、1.02～1.96、2.2、1.2、2.99、1.09～2.0。Kcat值（S-1）分別為3.5、38.5～44.5、184、4.16、2.8、1.59～6.2。Kcat/Km值分別為2.4、19.6～43.2、83.6、3.5、0.9、1.46～3.1。綜合上述數據，可知同樣條件下測得的鮭魚、鱈魚、虹鱒魚、金槍魚胰彈性蛋白酶的Km值相近，卻比豬的Km值小了近一倍，鮭魚胰彈性蛋白酶Kcat值（轉化率）較豬的胰彈性蛋白酶Kcat值高，從而Kcat/Km值（催化效率）比豬的胰彈性蛋白酶Kcat/Km值高了2.5倍。結果表明，四種魚類胰彈性蛋白酶與底物Suc-AAA-pNA的親和力相近，但要比豬胰彈性蛋白酶的底物親和力小；大西洋鮭魚彈性蛋白酶作為一種適冷酶為了適應低溫的生活環境，催化效率是豬的胰彈性蛋白酶的2.5倍。綜合來自魚類和哺乳動物的胰彈性蛋白酶動力學參數，盡管催化效率各不相同，但魚類胰彈性蛋白酶擁有比哺乳動物胰彈性蛋白酶更高的催化效率。?
2.3抑制劑影響胰彈性蛋白酶活力的研究?
胰彈性蛋白酶的抑制劑屬于絲氨酸蛋白酶抑制劑家族，是一種能夠降低胰彈性蛋白酶活力的物質。以大西洋鮭魚，鱈魚和角鯊為例，其彈性蛋白酶活性能被絲氨酸蛋白酶抑制劑苯甲磺酰氯（PMSF）、抑彈性蛋白酶醛（Elastatianl）和MPCMK強烈抑制，表現出絲氨酸蛋白酶家族成員的共有特征。但是苯甲脒、牛胰蛋白酶抑制劑（BPTI）和亮肽素等胰蛋白酶特異性抑制劑對大西洋鮭魚胰彈性蛋白酶活力卻無明顯影響，這又表現出彈性蛋白酶與其他絲氨酸蛋白酶家族成員的性質差異。?
L-半胱氨酸，一種金屬離子螯合劑和巰基阻斷劑，對魚類和哺乳動物胰彈性蛋白酶均有抑制效應。但是二價金屬離子螯合劑EDTA，對魚類和哺乳動物胰彈性蛋白酶均無明顯抑制效應。體現了不同種屬來源的胰彈性蛋白酶的共性。通過比較，發現魚類胰彈性蛋白酶比哺乳動物胰彈性蛋白酶對PMSF更敏感；碘乙酰胺，一種巰基改良劑，對魚類胰彈性蛋白酶無影響，卻對哺乳動物胰彈性蛋白酶有輕微抑制效應；大豆胰蛋白酶抑制劑能抑制鱈魚胰彈性蛋白酶活力，對豬胰彈性蛋白酶活力卻無影響。上述報道說明，不同種屬來源的胰彈性蛋白酶對抑制劑的敏感程度不同，存在差異。?
2.4胰彈性蛋白酶相對分子質量和等電點的研究?
魚類胰彈性蛋白酶的相對分子質量一般是通過SDS-PAGE凝膠電泳測定。硬骨魚類胰彈性蛋白酶的相對分子質量為24-29KDa。Berglund GI等測得大西洋鮭的胰彈性蛋白酶相對分子質量為27 KDa、大西洋鱈魚24.8 KDa、歐洲鲇魚24 KDa、Dover sole19.5 KDa。甲殼動物、哺乳動物和禽類的胰彈性蛋白酶分子質量也在這個范圍，如測得中國鱟胰彈性蛋白酶相對分子質量為28.5 KDa，智人26.3 KDa，鼠29KDa，牛29 KDa，綿羊25 KDa，雞25 KDa。
總結許多學者的研究報道，魚類胰彈性蛋白酶的等電點一般在6～9.5范圍內。如測得大西洋鮭的胰彈性蛋白酶PI大于9.3、大西洋鱈魚9.3、Dover sole 5.7。所以，在中性條件下，絕大部分胰彈性蛋白酶都屬于中性偏堿性蛋白酶，只有個別魚類胰彈性蛋白酶為弱酸性，如歐洲鲇魚胰液純化得出的兩種帶電不同的胰彈性蛋白酶亞型的PI分別為6.17/8.48，一種屬于堿性胰彈性蛋白酶，而另外一種屬于弱酸性胰彈性蛋白酶。?
3胰彈性蛋白酶的序列分析與系統進化分析?
哺乳動物包括豬、鼠、人的彈性蛋白酶氨基酸序列測定已經完成，編碼區分別由266、266、269個氨基酸殘基組成，具有較高的同源性。魚類與哺乳動物的胰彈性蛋白酶氨基酸組成存在相似性，但是無論是殘基數目還是組成上都存在差異。登陸GenBank能搜索到大西洋鮭魚和日本比目魚彈性蛋白酶編碼區完整序列信息，分別由181和266/268（EL1/EL4兩個亞型）個氨基酸殘基組成。將角鯊的兩種胰彈性蛋白酶亞型EI和EII的氨基端序列（各20個殘基）與人和鼠的胰彈性蛋白酶編碼區氨基酸序列進行比對，具有85%的同源性。兩棲動物中非洲爪蟾的編碼區由264個氨基酸殘基組成。?
生物進化分析是生物信息學的一個分支。它通過對生物序列的研究推測物種的進化歷史。主要通過DNA序列，蛋白質序列，蛋白質結構等來構建分子進化樹或者種系發生樹。將日本比目魚與其他硬骨魚如鱈魚、鮭魚和哺乳動物如鼠以及人的胰絲氨酸蛋白酶基因構建系統進化分析，從構建的進化樹得知日本比目魚胰蛋白酶基因、胰凝乳蛋白酶基因和彈性蛋白酶基因的首次倍增與硬骨魚、哺乳動物胰絲氨酸蛋白酶基因構成的簇的首次倍增發生在同時期。硬骨魚彈性蛋白酶基因與哺乳動物彈性蛋白酶的分歧時間要晚于首次倍增。因此，可以得知胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和彈性蛋白酶的首次倍增早于硬骨魚類的分化。?
4小結?
彈性蛋白酶是廣泛應用于醫藥工業、食品工業、畜牧業和現代生物技術領域的一種非常重要的酶。目前，彈性蛋白酶主要作為治療高血脂癥、防止動脈粥樣硬化的生化藥物。同時由于其廣譜的蛋白水解活性，不僅在醫藥工業，而且在食品工業、日化工業上也有著廣闊的應用前景和較高的商業價值。較高活性胰彈性蛋白酶的提取利用，還有利于水產品加工過程中廢棄物的充分利用。在眾多蛋白質水解酶中，胰彈性蛋白酶的年消耗量占酶制品世界市場的比例逐年上升。?
胰彈性蛋白酶的純化及其特性的研究，不僅有助于了解胰彈性蛋白酶結構與功能的關系，而且有助于探究魚類的消化生理特點，為水產飼料的設計提供理論依據，為確立魚類適宜養殖條件提供基礎數據。但是到目前為止，魚類胰彈性蛋白酶的研究在國內還處于剛剛起步的階段，迫切需要對胰彈性蛋白酶的基礎理論進行更加深入透徹的研究，使該研究領域趕超世界先進水平。?
