圖像處理和函數型數據分析的高通量表型方法分析
高通量表型是植物學研究領域中的新興技術。許多自動化表型系統已在溫室和田間場景中得到了應用以研究植物的特征。其中最主要的創新之一是使用自動化圖像采集設備來獲取植物的原始圖像：在設定的時間點為大量的植物記錄多種類型（包括RGB、紅外、熒光和高光譜等）的高分辨率圖像。從圖像中我們可以處理和提取有用的表型特征，如植物的高度、寬度和大小。與傳統方法相比，高通量表型系統能夠以更高效、準確和無損的方式來提供研究者感興趣的植物特征。
為了提取植物性狀，需要對植株的某個部分或整個植株進行分割。閾值分割是最簡單、最常用的圖像分割方法，它通過像素強度的臨界值將圖像分類為前景和背景。基于閾值分割方法，一些用于高通量植物表型分析的平臺已被開發，包括HTPheno、Image Harvest和PlantCV等。上述軟件采用了公認的步驟來處理植物圖像并提取表型特征。然而這些平臺僅專注于圖像處理，對植物生長過程的統計建模和推斷方面的功能有所欠缺。
K均值聚類也是一種著名的圖像分割算法，該算法將像素分配到子組中，并使得組內像素強度變化最小。當簇的數量給定時，K均值方法無需調整參數選擇。隱馬爾可夫隨機場模型（HMRF）可用于優化來自K均值聚類和閾值分割的分割結果。HMRF是具有馬爾可夫隨機場隱藏層的層次模型，用于針對每個像素的類標簽進行建模，從而捕獲像素對其鄰近像素的空間依賴性。由于閾值分割和K均值算法都忽略了圖像的空間結構，因此HMRF模型能夠通過像素的鄰域類別信息來進行像素合并，從而提供更準確的像素分類。
假設圖像分割是精確的，那么就可以從圖像中提取出表型性狀的測量值。這些量化的數值可用于分析不同的基因型或處理隨時間對植物生長的影響。在傳統的生長曲線分析中，會在每個測量時間點逐點采用方差分析的方法。然而，這種獨立地分析每個時間點的方法無法反映出植物的動態生長過程。對生長曲線進行參數化建模是另外一種常用的方法，但是參數模型的擬合需要測量全生育期的植物性狀數據，且常常會忽略數據的時間相依性，這使得此方法可能無法用于某些實驗場景。函數型方差分析是一個新的非參數分析方法，可用于分析按時間序列采集的植物性狀數據。在函數型方差分析中，使用了樣條曲線平滑和局部多項式回歸方法來代替參數回歸進行植物生長過程的估計。這樣的非參數方法完全由數據驅動，且適應于數據的時間相依性。雖然函數型方差分析方法有如上優點，實現植物表型數據的函數型方差分析卻并不容易。目前用于函數型數據分析的R語言程序包“fda”非常復雜，對于非統計學背景的研究者而言，使用時會存在困難。在使用函數型方差分析對植物生長過程的研究中，當前也沒有相關的計算教程。
近日，Plant Phenomics?刊發了美國內布拉斯加大學林肯分校(University of Nebraska-Lincoln)及愛荷華州立大學(Iowa State University)的Ronghao Wang、Yumou Qiu等人的題為A High-Throughput Phenotyping Pipeline for Image Processing and Functional Growth Curve Analysis?的研究論文。為了滿足高通量表型系統數據分析的需求，論文作者開發了一個R語言程序包“implant”，涵蓋了對所提取特征的圖像分析和函數型數據分析。文章提供了一個簡單易用的方法來分析原始圖像和數據分析中的高通量表型數據。相比于主要聚焦在介紹非參數曲線擬合方法的論文，本文上述的程序包提供了一個對用戶友好的計算工具，可使植物學家輕松地對植物動態生長過程進行函數型數據分析。此外，該程序包還提供了隨時間變化而變化的回歸系數的置信區間(Figure 3)。
Figure?3.?(a) 95% confidence regions for the average plant size of genotypes 1 and 3 over the three blocks. (b) 95% confidence regions for the average plant size of genotypes 2 and 3 over the three blocks.
下列流程圖(Figure
1)闡述了該方法的主要步驟。首先，采用雙標準閾值(DCT)或HMRF方法完成對植株的分割。如果有不包含植株的容器圖像，那么DCT可用于對比含植株和不含植株的容器圖像（如Figures
2(a)–2(c)所示）。在第二步(Figure
2)中，使用形態學腐蝕和膨脹的方法來優化對植株區域的識別和分割。接著基于分割后的圖像計算植株性狀。最后，對提取出的性狀進行函數型數據分析和統計學推斷。
Figure?1.?Flow chart of the proposed “implant” pipeline. In the first
step of segmentation, multiple methods could be jointly applied and the
common plant area is considered to be the final segmentation.
Figure?2.?(a) Original plant image. (b) Original empty pot image; the red square is the identified region of interest by the functions “ColorB” and “ColorG.” (c) Contrast of (a) and (b). (d) Segmented image of (a) using DCT. (e) Segmented image of (c) using DCT. (f) Intersection of (d) and (e). (g) Dilated-eroded-eroded-dilated image of (f). (h) Final segmented image by identifying the region of interest.
該方法能夠估計植物生長過程中的主要影響因素和干擾因素，并處理不合理的觀察時間點，給出影響因素曲線的置信區間(Figure5)。這些置信區間可以證明隨著時間推移，不同的基因型和處理所造成影響的統計學意義。
Figure 5.?(a) 95% confidence region for the block effect between block 3 and block 1. (b) 95% confidence region for the genotype effect between genotype 2 and genotype 3.
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https://spj.sciencemag.org/journals/plantphenomics/2020/4152816/
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About?Plant Phenomics
《植物表型組學》（Plant Phenomics）是由南京農業大學和美國科學促進會（AAAS）合作創辦的英文學術期刊，于2019年1月正式上線發行，是Science合作出版的第二本期刊。采用開放獲取形式，刊載植物表型組學交叉學科熱點領域具有突破性科研進展的原創性研究論文、綜述、數據集和觀點。具體范圍涵蓋高通量表型分析的最新技術，基于圖像分析和機器學習的表型分析研究，提取表型信息的新算法，作物栽培、植物育種和農業實踐中的表型組學新應用，與植物表型相結合的分子生物學、植物生理學、統計學、作物模型和其他組學研究，表型組學相關的植物生物學等。期刊已被CABI、CNKI和DOAJ數據庫收錄。
說明：本文由《植物表型組學》編輯部負責組稿。
中文內容僅供參考，一切內容以英文原版為準。
撰稿：王棟（實習）
編輯：周燦彧（實習）、孔敏
審核：尹歡
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