植物根系活力測定(α-萘胺氧化法)
實驗概要
掌握用α-萘胺氧化法測定植物根系活力。
實驗原理
植物根系是活躍的吸收器官和合成器官，根的生長情況和代謝水平即根系活力直接影響植物地上部的生長和營養狀況以及產量，是植物生長的重要生理指標之一。
植物根系能氧化α-萘胺，生成紅色的α-羥基-1-萘胺，并沉淀于有氧化能力的根表面，使這部分跟染成紅色。根對α-萘胺的氧化能力與其呼吸強度有密切聯系。日本人相見、松中等認為α-萘胺氧化的本質就是過氧化物酶的作用，該酶的活力越強，對α-萘胺的氧化力也越強，染色也越深。所以既可以根據根系表面著色深淺，定性觀察并判斷根系活力大小，也可通過測定溶液中未被氧化的α-萘胺的量，以定量測定根系活力。
?α-萘胺在酸性環境中可于對氨基苯磺酸（sulfanil-amide）和亞硝酸鹽作用生成穩定的紅色偶氮染料。該紅色偶氮化合物在pH
7.0時在510nm處有最大吸收峰，可用分光光度法測定光吸收值，從而利用此反應來間接測定溶液中α-萘胺的量。反應液的酸度大則增加重氮化作用的速度，但降低偶聯作用的速度，顏色比較穩定。增加溫度可以增加反應速度，但降低重氮鹽的穩定度，所以反應需要在相同條件下進行。
主要試劑
α-萘胺溶液
0.1mol/L磷酸緩沖液，pH 7.0
1%對氨基苯磺酸溶液
亞硝酸鈉溶液
主要設備
分光光度計
恒溫培養箱
三角燒瓶
量筒
移液管
剪刀
玻棒
實驗材料
荇菜
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實驗步驟
1.
取50ug/mLα-萘胺和0.1mol/L pH
7.0的磷酸緩沖液各10ml置于三角瓶中，混勻。分別取不同濃度汞離子脅迫的植株的根系，洗凈后再用濾紙吸干。分別稱取根系1-2g浸沒于三角瓶中的溶液中。同樣地，取50ug/mL的α-萘胺溶液和0.1mol/L
pH 7.0的磷酸緩沖液各10ml置于另一三角瓶中混勻，不放根系作為對照。五分鐘后分別從兩瓶中各取2ml，按照步驟3做第一次測定。
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2. 將三角瓶置于25攝氏度恒溫箱中保溫60分鐘后，各取2ml，按照步驟3做第二次測定。
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3. a-萘胺含量測定：取2ml培養液加10ml水 混勻，再順次加入對氨基苯磺酸溶液與亞硝酸鈉溶液各1ml混勻，觀察溶液顏色變化再定容至25ml，室溫25分鐘后于510nm處測定吸光度OD值。
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4. 標準曲線制作以50um/ml的a-萘胺溶液為母液配置40，30，20，10，5，0ug/ml 的溶液各10ml。各取2ml，按照步驟3分別反應，并測定OD值，以OD值為縱坐標，濃度為橫坐標繪制a-萘胺溶液的標準曲線。
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5. 分別查對標準曲線計算出實驗組與對照組溶液試驗前后對應的a-萘胺溶液濃度。
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6. 根據實驗結果計算不同植株根系對a-萘胺的生物氧化強度，并于植物生長勢比較，分析它們之間的關系。
例如，1 g鮮根，振蕩3小時，以第一次取樣時的α-萘胺濃度為A（是根上吸附的氧化鐵氧化α-萘胺后剩余的α-萘胺濃度，亦即酶促反應前α-萘胺的起始濃度），第二次取樣時的α-萘胺濃度為B（即根在酶促反應3小時后剩余的α-萘胺濃度）。所以A-B為根的α-萘胺氧化量，C為空白試驗時α-萘胺減少的濃度（即α-萘胺在振蕩3小時的自身氧化量）。由于所用溶液是等體積的40 mg/Lα-萘胺溶液和磷酸緩沖溶液，共50 mL，所以每mLα-萘胺含量為20 μg，X為稀釋液體積（mL），由于取樣為2 mL，酶促反應是在48 mL的α-萘胺溶液中進行的，其計算公式如下：
其中：Y代表α-萘胺氧化量（μg/ g鮮根/小時）
3代表酶促反應時間
注意事項
為什么用紫外吸收法測過氧化氫酶活性時的平行測定相差會很大？同樣的酶液，同樣的方法，只是讀數時間有幾秒的差異，但是吸光度為什么會相差很大？測定前為什么要25度預熱？讀數都是負的嗎？要是有正的說明什么？
解釋是：酶的催化速度很快的，所以底物消耗得很快，催化速度的測定只能取直線變化的那段數據，只有這時的數據是可靠的。測定前要25度預熱，預熱是為了達到酶催化的最適溫度，讀數是不是負的，要看是拿什么溶液來校正的，底物減少，吸光度減少，數值就減少了，到最后就變成負的了，速度是用差值算的，和絕對數值無關。
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