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數十個測序平臺技術參數盤點

2021.6.30

1.第二代測序技術

1.1 Roche 454 測序平臺

Roche 454（Genome Sequencer 20 System）是第一個NGS測序平臺，由美國454 Life Sciences公司于2005年推出，2007年被瑞士Roche公司收購。此后Roche公司在此基礎上開發了Roche GSTitanium、Roche GS FLX+、Roche GS Junior和Roche GS Junior+。Roche 454是一種基于微乳液PCR和焦磷酸測序技術的測序平臺。

Roche 454測序平臺具有較長的測序讀長和短耗時的優勢，準確性高達99.9%，達到了與Sanger測序法相當的長度與準確性，并降低了測序成本。Roche 454測序主要應用領域有微生物群落多樣性分析（如16s、18s、ITS擴增子測序）、復雜環境樣品的宏基因組學研究、微生物基因組的從頭測序、轉錄組測序、外顯子測序、目標區域捕獲測序和病原菌檢測等。然而，Roche 454 平臺也存在一些不足，比如焦磷酸測序試劑成本相對較高，樣本制備相對較復雜，對重復和同種堿基聚合區域難以處理，以及試劑沖洗帶來的錯誤積累等。隨著測序儀器的更新，454平臺無論從擴展性還是從成本來看都很難再次升級和改良，故Roche公司宣布自2016年逐步淘汰焦磷酸測序儀器的生產。

1.2 Illumina 測序平臺

美國Solexa公司于2006年推出GA，2007年被Illumina公司收購，此后Illumina公司又開發了GAⅡX、HiSeq 2500、HiSeq 3000、HiSeq 4000、HiSeq X Ten、HiSeq X Five、NextSeq 500、MiSeq系列和MiniSeq系統。

該系統能夠在一天內測序整個人類基因組和多達16個外顯子組，NextSeq500運行75個測序循環只需12 h。此外，Illumina測序成本最低，因此應用最廣泛，幾乎涵蓋了測序應用的各個方面，比如基因組學的全基因組從頭測序、重測序、外顯子和目標區域捕獲測序；轉錄組學的轉錄組測序、數字基因表達譜測序、微小RNA測序和降解組測序；表觀組學的甲基化測序、簡化甲基化測序和甲基化DNA免疫共沉淀測序等。然而，Illumina平臺由于讀長較短，會導至后期用于數據刪節和分析的費用增高。

1.3. SOLiD測序平臺

SOLiD測序技術由美國Agencourt公司開發，2006年被ABI公司收購。ABI于2007推出SOLiD的第一個測序平臺，2010年又推出SOLiD 5500XL。同Roche 454測序平臺一樣，SOLiD也采用微乳液PCR，不同之處在于其采用寡核苷酸連接測序。

SOLiD一次循環可產生75～110 bp讀長，產生300 Gb的測序序列。同Illumina一樣，SOLiD可用于全基因組重測序確定單核苷酸多態性、缺失和插入等基因組結構變異，也可用于目標區域捕獲測序、染色質免疫共沉淀測序和RAN測序，但讀長短、成本高和數據結果分析困難的不足使其應用受限。

1.4.??Ion Torrent PGM和Proton半導體測序

美國Ion Torrent公司自2010年被Life Technologies收購后陸續推出Ion Torrent PGM（2010年）和Proton （2012年），二者是介于第二代和第三代之間的測序平臺，其核心技術是Ion Torrent公司開發的半導體測序。Ion Torrent PGM通量低，但速度快，成本低且儀器規模小，因此應用廣泛，適合16s RNA測序、微生物和病毒的從頭測序和重測序、目標區域捕獲測序、單核苷酸多態性檢測、短串聯重復序列測序、混合感染鑒定和線粒體DNA測序等。但Ion Torrent PGM也存在因多次洗脫過程導至的錯誤累積、閱讀高度重復序列和同種多聚序列時出錯率高等不足。現有Roche GS Junior、Ion TorrentPGM和MiSeq 3種針對臨床和中小型實驗室的小型測序儀。

2.第三代測序技術

第三代測序技術是在第二代基礎上增加讀長，降低試劑成本，并且加快運行速度。其顯著特點是單分子測序，即不經PCR直接進行邊合成邊測序，不僅簡化了樣品處理過程，避免了擴增可能引入的錯配，而且不受鳥嘌呤和胞嘧啶或腺嘌呤和胸腺嘧啶含量的影響，因此第三代測序技術能直接對RNA和甲基化DNA序列進行測序。現有的第三代測序平臺包括美國Helicos Bioscience 公司的HeliScope遺傳分析系統和Pacific Biosciences公司的PacBio RS單分子實時測序系統。

2.1.??HeliScope遺傳分析系統

HeliScope 遺傳分析系統為第一個單分子測序系統，由美國Helicos Bioscience 公司于2008年推出。HeliScope遺傳分析系統所需樣本量較少且對樣本質量要求低，可用于古生物信息檢測。HeliScope遺傳分析系統最常用于基因表達分析，如在哺乳動物基因功能注解計劃中用Heli-Scope進行基因表達加帽分析。

2.2.??PacBioRS單分子實時測序系統

PacBio RS單分子實時測序系統由美國Pacific Biosciences公司于2010年推出。PacBio RS 單分子實時測序系統的優勢在于讀長，最新的PacBio RSⅡ讀長可達20 kb。PacBio RS每次循環產生400 Mb序列，成本為2~17 美元/ Mb，與其他NGS平臺相比，其通量低，成本高，且單堿基識別錯誤率高達14%，但可通過提高循環次數來改善，也可與第二代測序技術聯合應用以降低成本并提高準確度。Rhoads 等最近的研究表明PacBio RS適合于從頭測序、基因結構突變檢測、復雜重復序列測序、發現基因亞型、4-甲基胞嘧啶和6-甲基腺嘌呤檢測。

2.3.??納米孔測序技術

納米孔測序技術雖屬單分子測序，但不同于HeliScope遺傳分析系統和PacBio RS單分子實時測序平臺，它無需進行合成反應、熒光標記、洗脫和電荷耦合器件（charge couple device，CCD）照相機攝像，實現了從光學檢測到電子傳導檢測和短讀長到長讀長測序的雙重跨越。英國Oxford Nanopore Technologies公司現已推出高通量的GridION和U盤大小的MinION測序儀。瑞士Roche公司、美國Illumina 和Life Technologies 等公司也在投資納米孔測序，如Roche 投資了Genia Technologies和Stratos Genomics 公司。與其他NGS平臺相比，納米孔測序技術具有長讀長、高通量、低成本、短耗時和數據分析相對簡單的優勢，未來納米孔測序技術投入市場后有望在幾小時、幾百美元的成本內完成全基因組測序。

測序平臺技術參數盤點

表1：各測序平臺對比

參考文獻: ?

1. S Goodwin, JD McPherson, WR McCombie, et al. Comingof age: ten years of next-generation sequencing technologies. Nature ReviewsGenetics, 2016.

2. Ellis,?M.?J. et?al. Whole-genomeanalysis informs breast cancer response to aromatase inhibition. Nature, 2012.

3. Chan,?M. et?al. Development of anext-generation sequencing method for BRCA mutation screening:a?comparison between a high-throughput and a benchtop platform.J.?Mol. Diagnost, 2012.

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