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一管血檢測8種癌癥液態活檢助力反映腫瘤基因圖譜

2018.2.22

　　約翰霍普金斯大學醫學院的科研人員1月18日在《Science》上發表了一篇文章，報道了一種名叫“CancerSEEK”的癌癥早期篩查新方法，只需要從檢測對象體內抽取一管血，便可檢測出8種癌癥。這一消息迅速“刷屏”，包括新浪醫藥在內的廣大媒體紛紛轉發。

　　首先得說，“CancerSEEK”作為液體活檢領域的一項新技術，針對5種目前還沒有早期篩查手段的癌癥，它的敏感性在69%-98%，特異性更是超過99%，且價格只要500美元。這的確是很大的突破。但這一優秀的表現是在晚期癌癥患者身上得到的，對于早期尚無癥狀的癌癥患者，“CancerSEEK”就“無計可施”了，而這正是液體活檢技術面臨的艱巨挑戰之一。

　　在精準醫學的大背景下，液體活檢作為一種便捷、微創、能夠動態反映腫瘤基因譜全貌的方法，在癌癥臨床研究與實踐中發揮著越來越重要的作用。用于液體活檢相應的多種檢測技術也如雨后春筍一般蓬勃發展。

　　目前液體活檢的檢測對象主要包括以下三種：循環腫瘤細胞（CTC）、循環腫瘤DNA（ct DNA）和外泌體。

　　循環腫瘤細胞

　　通常把進入人體外周血的腫瘤細胞稱為循環腫瘤細胞。1869年Ashworth首次提出循環腫瘤細胞（CTC）的概念。大量研究表明，CTC以不同形態存在于腫瘤患者的外周血中，既有游離的單個CTC，也有聚集成團的細胞團，它們是惡性腫瘤出現血行轉移的主要生物基礎，其數量的多少與患者的預后密切相關。

　　研究表明，CTC具有很強的預后判斷和轉移預測價值，并且在早期輔助診斷方面也有很好的應用。因此，早期發現血液中的CTC對患者預后判斷、療效評價和精準治療都有重要的指導意義。目前CTC的富集、檢測和分析技術如表1所示。

表1、目前CTC的富集、檢測和分析技術

富集方法		檢測和分析方法
依據物理學特征(大小、密度、電荷及可塑性等)	密度梯度離心法、膜過濾法、介電電泳法	免疫熒光方法分析CTC表面標志物。單細胞全基因組測序技術是在單細胞水平對全基因組進行擴增與測序的一項新技術,用于分析CTC的基因突變與基因組異常等。 RT-PCR和芯片方法用于檢測CTC中高表達的mRNA或突變性質的基因。免疫斑點法通過檢測細胞在短時間培養中分泌、脫落或釋放的蛋白質,對有功能活性的CTC進行評估。原位雜交技術可用于檢測CTC的基因擴增與基因重排的情況。
			依據生物學特征(抗原表達、蛋白分泌及侵襲性等)	免疫磁珠(陽性富集和陰性富集)、微流控技術

　　以陽性富集檢測CTC的CellSearch系統是美國FDA最早批準用于臨床的檢測方法，但僅限于乳腺癌、前列腺癌和結直腸癌，對于肺癌其檢測特異性和靈敏度均不理想。在我國，首個專門針對非小細胞肺癌循環腫瘤細胞檢測的試劑盒（葉酸陽性富集），也通過了CFDA的臨床審批。

　　Alix-Panabieres等報道了CTC在科學研究和臨床轉化中的應用價值。

　　計數成活的CTC可能提示疾病預后；

　　通過體外培養CTC并深入分析成系CTC可能識別新藥研發潛在靶點；

　　體外擴增CTC構建PDX模型進行藥物篩選和耐藥機制研究將可能根除腫瘤轉移。

　　循環腫瘤DNA

　　1948年，科學家首次報道發現了人類血液中循環的DNA；1977年，發現血液中循環的DNA在癌癥患者中尤為顯著；1994年，發現在癌癥患者血液中循環的DNA所攜帶的突變與癌癥突變相吻合，證明它來源于腫瘤細胞。

　　人的血漿中游離存在高度片段化的游離DNA（cf DNA），它們有的來自于正常細胞，有的來自于異常細胞（如腫瘤細胞），還有部分來自于人體外部（如病毒DNA）。ct DNA是由腫瘤細胞釋放到血液循環中的DNA片段，因此含有原發腫瘤的突變信息，如單堿基突變、甲基化和拷貝數突變等。ct DNA作為一種特征性的腫瘤生物標志物，可以被定性分析、定量檢測和實時追蹤。

　　ct DNA在腫瘤疾病的含量非常稀少，新的技術革新可以從cf DNA中區別目標ct DNA并加以檢測。目前ct DNA檢測技術如表2所示。

表2、目前ct DNA檢測技術

原理	方法	檢測變異類型	憂點	缺點
基于PCR	Nested real-time PCR	檢測已知的點突變	操作簡便、成本低	敏感性低、只能檢測有限的突變位點
	ARMS/Scorpion PCR
	PCR-SSCP
	Mutant allele-specific PCR
	Mass spectrometry
	Bi-PAP-A
	amplification
	dd PCR	檢測已知的點突變和基因重排	敏感性高	只能檢測有限的突變位點
	BEAMing	檢測已知的點突變和基因重排	敏感性高	只能檢測有限的突變位點
目標深度測序	Safe-Seq、Tam-Seq、lon Ampli- Seq、CAPP-Seq、On- Target	目標區域單核苷酸變異(SNVs)、拷貝數異常(CNV)和重排	敏感性高	較昂貴
全基因組測序	Digital karyotyping、PARE	基因組范圍SNVs、CNVs和重排	應用范圍廣	很昂貴

　　目前ct DNA的主要檢測方法是PCR和二代測序（NGS）技術。釋放到血漿的小片段ct DNA可運用數字微滴PCR（dd PCR）、BEAMing等高敏感度的檢測方法檢測；大片段ct DNA可運用如全基因組測序等敏感度相對低的檢測方法檢測。

　　PCR（聚合酶鏈式反應）是生物科學領域最基本也最重要的基因診斷技術。從1985年PCR作為生物ZL技術首次亮相以來，已歷經第二代熒光定量PCR（qPCR）到第三代數字PCR（dPCR）的更新迭代。據估計，全球PCR市場規模到2022年預計可增長至53.1億美元，2017~2022年期間的復合年增長率預計可達8.9%。

　　NGS 技術的發展使ct DNA中腫瘤特異性的基因突變或者拷貝數異常（CNV）通過ct DNA檢測成為可能，這種高通量基因檢測方式具有非常高的敏感性，并能精確地捕捉到臨床治療過程中患者體內微量ct DNA的變化，是目前公認最有效的分析方法。然而，NGS也存在一些不足之處，由這些技術帶來的昂貴費用、龐大數據處理以及高質量DNA樣本的依賴是目前需要克服的問題。

　　NGS可進行靶向重測序、全外顯子組測序、RNA測序、全基因組測序、ChIP測序、從頭測序和甲基化測序等。Illumina公司在NGS市場是龍頭老大，其次是賽默飛世爾科技與羅氏公司。

　　針對ct DNA基因突變的檢測，羅氏開發了首個肺癌ct DNA中EGFR突變的液體活檢試劑盒，已獲得美國FDA的批準。

　　ct DNA可用于評估腫瘤分子異質性、監測腫瘤動態變化、尋找靶點、療效評價和動態評估耐藥的發生。在腫瘤診斷、預后評估、治療療效及耐藥監測中均具有臨床價值。

　　外泌體

　　外泌體首次被發現于網狀細胞中，是一種直徑約30～100nm，密度為1.13~1.19g/ml的胞外囊泡。當細胞遭受壓力，如腫瘤細胞在遭受放化療及含氧量低的情況下，會釋放大量的外泌體，因此，腫瘤患者血清中的外泌體含量顯著高于正常人體內的，同時在腫瘤患者尿液、唾液和胸腹水中都發現外泌體的存在。

　　外泌體可以攜帶miRNA、DNA片段、蛋白質等物質在細胞和組織之間自由穿梭，被認為參與細胞間的通訊網絡，它可以重新編碼靶細胞的基因，在腫瘤的侵襲轉移及耐藥性方面發揮作用。

　　由于腫瘤患者外泌體富含大量的mi RNA、m RNA和蛋白質等信息，且含量顯著高于正常人，因此外泌體被認為在輔助診斷上發揮功能。

　　另外，由于外泌體在腫瘤的生長、轉移中發揮重要作用，因此，抑制外泌體的形成和釋放可能是潛在的治療腫瘤的新策略。

　　中國共識

　　現階段，液體活檢研究一片繁榮，但業內檢測技術良莠不齊，缺乏統一規范的標準。2016年中國臨床腫瘤學會（ChineseSociety of Clinical Oncology，CSCO）和中國抗癌協會肺癌專業委員會，在聯合主辦的第13屆“中國肺癌高峰論壇”上就液體活檢技術達成了部分專家共識，如表3所示。

　　從三種檢測對象，看液態活檢助力反映腫瘤基因圖譜

表3、目前中國就液體活檢技術達成的部分共識

共識序列	共識內容	共識級別
共識一	精準醫學是一項系統工程,包括以下四個連續的過程： (1)發現具有臨床意義的基因異常(可靶點抑制、預測和/或預后標志物)。 (2)發現可靶向特異基因異常的藥物。 (3)尋找證明其特異的有效性安全性證據。 (4)應用于臨床證明了證據的可重復性。	1B
共識二	液體活檢包括血液循環腫瘤細胞、血漿游離DNA和外泌體。	2A
共識三	檢測已知的、單個臨床可藥物抑制的靶點,液體活檢技術推薦ARMS方法；檢測已知的、多個平行臨床可藥物抑制的靶點,液體活檢技術推薦NGS方法。	2A
共識四	用于發現未知基因,探索療效監測、預后判斷和發現耐藥機制等,液體活檢技術建議使用NGS。	2A
共識五	CTC和ctDNA可能用于肺癌早期診斷和復發監測但目前僅限于科硏探索。	2A
共識六	NGS用于臨床研究,需平衡患者利益、倫理要求和科學發現之間的關系，以患者利益為至上。	2A
本公式級別為： 1A級:基于高水平證據(嚴謹的Meta分析或RCT結果),專家組有統一認識； 1B級:基于高水平證據(嚴謹的Meta分析或RGT結果),專家組有小爭議； 2A級:基于低水平證據,專家組有統一認識； 2B級:基于低水平證據,專家組無統一認識,但爭議不大； 3級:專家組存在較大爭議。

　　結語

　　液體活檢作為精準醫療新技術，使得癌癥早期階段的篩查成為可能，在腫瘤診斷、治療方案指導、療效評估及預后測評領域，都具有極高的臨床應用價值和市場前景。但現階段液體活檢技術還存在著成本高、市場規范度不佳、檢測質量難以保證等缺點，此外，液體活檢還必須平衡早期診斷的獲益和帶給公眾精神心理的壓力等諸多倫理問題。期待通過臨床醫師、技術專家和政府部門三方深入探討，推動液體活檢技術在腫瘤精準診療中應用的規范化和合法化。盡管目前液體活檢技術仍主要用于科學研究，但它走向大規模臨床應用的時代即將到來。

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