ELISA方法的基本類型、用途及操作程序

酶聯免疫吸附試驗 (以下簡稱ELISA) ：是酶免疫測定技術中應用最廣的技術。其基本方法是將已知的抗原或抗體吸附在固相載體 ( 聚苯乙烯微量反應板 ) 表面，使酶標記的抗原-抗體反應在固相表面進行，用洗滌法將液相中的游離成分洗除。常用的 ELISA 法有雙抗體夾心法和間接法，前者用于檢測大分子抗原，后者用于測定特異抗體。
?????根據ELISA所用的固相載體而區分為三大類型：一是采用聚苯乙烯微量板為載體的ELISA，即我們通常所指的ELISA（微量板ELISA）；另一類是用硝酸纖維膜為載體的ELISA,稱為斑點ELISA（Dot-ELISA）;再一類是采用疏水性聚脂布作為載體的ELISA，稱為布ELISA（C-ELISA）。在微量板ELISA中，又根據其性質不同分為間接ELISA、雙抗體夾心ELISA、雙夾心ELISA、競爭ELISA、阻斷ELISA及抗體捕捉ELISA。
1、間接ELISA?
?????本法主要用于檢測抗體。以鴨病毒性肝炎（DVH）抗體的ELISA為例，間接ELISA的操作程序如下：
(1) 材料
① 包被液、洗滌液、保溫液、底物液、終止液；
② DVH包被抗原、酶標抗抗體、陰性及陽性DVH參考血清；待檢鴨血清；
③ ELISA檢測儀、加樣器、聚苯乙烯微量板。
(2) 方法步驟
① 加抗原包被 → 4℃過夜，洗滌三次、拋干
② 加待檢血清 → 37℃ 2小時，洗滌三次、拋干
③ 加酶標抗體 → 37℃ 2小時，洗滌三次、拋干
④ 加底物液 → 37℃ 30分鐘，加終止液
⑤ 用ELISA檢測儀測定OD值，并計算出P/N比值。
(3) 結果判定 已知陽性血清與已知陰性血清的比值（P/N）≥2.1，而且已知陽性血清的OD值≥0.4；在上述條件成立的情況下，如果待檢血清與已知陰性血清的比值（P/N）≥2.1，而且待檢血清的OD值≥0.4，則判為陽性，否則判為陰性。
2、雙抗體夾心ELISA?
?????本法主要用于檢測大分子抗原。現以檢測雞傳染性法氏囊病病毒（IBDV）的雙夾心抗體ELISA為例介紹本法的操作程序。
① 加抗體包被 → 4℃過夜，洗滌三次、拋干
② 加待檢抗原 → 37℃ 30分鐘，洗滌三次、拋干
③ 加酶標抗體 → 37℃ 30分鐘，洗滌三次、拋干
④ 加底物液 → 37℃ 15分鐘，加終止液
⑤ 用ELISA檢測儀測定OD值。
3、雙夾心ELISA?
???? 此法與雙抗體夾心ELISA的主要區別在于：它是采用酶標抗抗體檢查多種大分子抗原，它不僅不必標記每一種抗體，還可提高試驗的敏感性。
此法的基本程序為：
① 加抗體（Ab-1）包被 → 4℃過夜，洗滌三次、拋干
② 加待檢抗原（Ag） → 37℃ 60分鐘，洗滌三次、拋干
③ 加用非同種動物生產的特異性抗體（Ab-2）→ 37℃ 60分鐘，洗滌三次、拋干
④ 加入酶標抗Ab-2抗體（AB-3）→ 37℃ 60分鐘，洗滌三次、拋干
⑤ 加底物液 → 37℃ 20分鐘，加終止液
⑥ 用ELISA檢測儀測定OD值。
4、競爭ELISA?
?????此法主要用于測定小分子抗原及半抗原，其原理類似于放射免疫測定。
其基本程序為：
① 抗體包被 → 4℃過夜，洗滌三次、拋干
② 加入待檢抗原及一定量的酶標抗原（對照孔僅加酶標抗原）→ 37℃ 60分鐘，洗滌三次、拋干
③ 加底物液 → 37℃ 20分鐘，加終止液
④ 用ELISA檢測儀測定OD值。
????被結合的酶標抗原的量由酶催化底物反應產生有色產物的量來確定，如果待檢溶液中抗原越多，被結合的標記抗原的量就越少，有色產物就減少，這樣根據有色產物的變化就可求出未知抗原的量。此法的優點在于快速、特異性高、且可用于小分子抗原及半抗原的檢測；其主要不足在于每種抗原都要進行酶標記，而且因為抗原的結構不同，還需應用不同的結合方法。此外，試驗中應用酶標抗原的量較多。5、阻斷ELISA?
?????本法主要用于檢測型特異性抗體。該方法現已成為豬傳染性胃腸炎（TGE）、豬偽狂犬病（PR）及豬胸膜肺炎（AP）的主要檢測方法。
下面以AP2型抗體的阻斷ELISA檢測法為例介紹其操作程序：
① 100μl AP2型工作量抗原包被 → 4℃過夜，洗滌三次、拋干
② 用200μl阻斷緩沖液進行封閉 → 37℃ 60分鐘，洗滌三次、拋干
③ 加工作量1:4稀釋被檢豬血清100μl → 37℃ 60分鐘，洗滌三次、拋干
④ 加100μl工作量兔抗AP2型血清 → 37℃ 30分鐘，洗滌三次、拋干
⑤ 加100μl工作量豬抗兔IgG-HRP → 37℃ 60分鐘，洗滌三次、拋干
⑥ 加100μl OPD底物液 → 37℃ 20分鐘，加終止液
⑦ 用ELISA檢測儀測定OD值。
????本試驗同時設標準陰、陽性血清對照、兔抗AP2型陽性對照、空白對照。
6、抗體捕捉ELISA?
????本法主要用于檢測IgM抗體。由于IgM抗體出現于感染早期，所以檢測出IgM，則可作為某種疾病的早期診斷。抗體捕捉ELISA根據所用標記方式不同可分為標記抗原、標記抗體、標記抗抗體捕捉ELISA等幾種，其中以標記抗原捕捉ELISA比較有代表性，該方法的主要程序為：
① 用抗u鏈（抗IgM重鏈）抗體包被→37℃ 60分鐘后置4℃過夜，洗滌三次、拋干
② 加待檢血清 → 37℃ 2小時，洗滌三次、拋干
③ 加酶標抗原 → 37℃ 60分鐘，洗滌三次、拋干
④ 加底物液 → 37℃ 20分鐘，加終止液
⑤ 用ELISA檢測儀測定OD值。
7、斑點ELISA（Dot-ELISA）?
?????與常規的微量板ELISA比較，Dot-ELISA具有簡便、節省抗原等優點，而且結果可長期保存；但其也有不足，主要是在結果判定上比較主觀，特異性不夠高等。該方法的主要操作程序為：
(1) 載體膜的預處理及抗原包被

?????取硝酸纖維素膜用蒸餾水浸泡后，稍加干燥進行壓圈。將陰性、陽性抗原及被檢測抗原適度稀釋后加入圈中，置37℃使硝酸纖維素膜徹底干燥。每張7cm×2.3cm的膜一般可點加40-53個樣品，每個壓圈可加抗原液1-20μl。
(2) 封閉

?????將硝酸纖維素膜置于封閉液中，37℃感作15-30分鐘。封閉液多采用含有正常動物血清、pH7.2或pH7.4的PBS。
(3) 加被檢血清

???? 可直接在抗原圈上加，也可剪下抗原圈、置于微量板孔中，再加入一定量適度稀釋的待檢血清，37℃反應一定時間，用洗滌液洗三次，每次1－3分鐘。洗滌液一般為一定濃度的PBS-Tween溶液。
(4) 加酶標抗體，37℃反應一定時間后，用洗滌液洗三次。
(5) 顯色

????加入新鮮配制的底物液，37℃反應一定時間后，去掉底物液，加蒸餾水洗滌終止反應。
(6) 結果判定

?????以陽性、陰險血清作為對照，膜片中央出現深棕紅色斑點者為陽性反應，否則為陰性反應。
8、布ELISA（C-ELISA）?
?????C-ELISA（Cloth-ELISA）是加拿大學者Blais, B. W.等于1989年建立的一種新型免疫檢測技術。該方法是以疏水性聚脂布（Hydrophobic Polyester Cloth）即滌綸布為固相載體，這種大孔徑的疏水布具有吸附樣品量大，可為免疫反應提供較大的表面積，提高反應的敏感性，且容易洗滌，不需特殊儀器等優點。其基本原理與Dot-ELISA類似，只是載體不同。以對布氏桿菌抗原的檢測為例，C－ELISA的主要程序為：
(1) 首先把抗布氏桿菌的血清包被（吸附）在聚脂布上，并經洗滌及封閉；
(2) 加被檢樣品并于室溫下感作30分鐘，然后洗5次；?
(3) 加酶標記的抗布氏桿菌抗體，于室溫下感作30分鐘，然后洗滌5次；?
(4) 加入底物液顯色；?
(5) 測定OD值。