免疫共沉淀技術路線

準備工作： 預冷PBS，RIPA Buffer，細胞刮子（用保鮮膜包好后，埋冰下），離心機 1. 用預冷的PBS洗滌細胞兩次，最后一次吸干PBS； 2. 加入預冷的RIPA Buffer(1ml/107個細胞、10cm培養皿或150cm2培養瓶，0.5ml/5×106個細胞、6cm培養皿、75cm2培養瓶) 3. 用預冷的細胞刮子將細胞從培養皿或培養瓶上刮下，把懸液轉到1.5EP管中，4℃，緩慢晃動15min（EP管插冰上，置水平搖床上） 4. 4℃，14000g離心15min，立即將上清轉移到一個新的 離心管 中 5. 準備Protein A agarose，用PBS 洗兩遍珠子，然后用PBS配制成50%濃度，建議減掉槍尖部分，避免在涉及瓊脂糖珠的操作中破壞瓊脂糖珠 6. 每1ml總蛋白中加入100μl Protein A瓊脂糖珠（50%），4℃搖晃10min（EP管插冰上，置水平搖床上），以去除非特異性雜蛋白，降低背景 7. 4℃，14000g離心15min，將上清轉移到一個新的 離心管 中，去除Protein A珠子 8. (Bradford 法)做蛋白標準曲線，測定蛋白濃度，測前將總蛋白至少稀釋1：10倍以上，以減少細胞裂解液中去垢劑的影響（定量，分裝后，可以在-20℃保存一個月） 9. 用PBS將總蛋白稀釋到約1 μg/μl，以降低裂解液中去垢劑的濃度，如果興趣蛋白在細胞中含量較低，則總蛋白濃度應該稍高（如10 μg/μl） 10. 加入一定體積的兔抗到500μl總蛋白中，抗體的稀釋比例因興趣蛋白在不同細胞系中的多少而異 11. 4℃緩慢搖動抗原抗體混合物過夜或室溫2h，激酶或磷酸酯酶活性分析建議用2 h室溫孵育 12. 加入100μl Protein A瓊脂糖珠來捕捉抗原抗體復合物，4℃緩慢搖動抗原抗體混合物過夜或室溫1h，如果所用抗體為鼠抗或雞抗，建議加2 μl“過渡抗體”（兔抗鼠IgG，兔抗雞IgG） 13. 14000rpm瞬時離心5s，收集瓊脂糖珠-抗原抗體復合物，去上清，用預冷的RIPA buffer洗3遍，800μl/遍，RIPA buffer有時候會破壞瓊脂糖珠-抗原抗體復合物內部的結合，可以使用PBS 14. 用60μl 2×上樣緩沖液將瓊脂糖珠-抗原抗體復合物懸起，輕輕混勻，緩沖液的量依據上樣多少的需要而定（60 μl足夠上三道） 15. 將上樣樣品煮5min，以游離抗原，抗體，珠子，離心，將上清電泳，收集剩余瓊脂糖珠，上清也可以暫時凍-20℃，留待以后電泳，電泳前應再次煮5min變性。 RIPA Buffer配制： 基礎成分： Tris-HCl（緩沖液成分，防止蛋白變性） NaCl（鹽份，防止非特異蛋白聚集） NP-40（非離子去污劑，提取蛋白；用H2O配制成10%儲存液） 去氧膽酸鈉（離子去污劑，提取蛋白；用H2O配制成10%儲存液；避光保存） 注意：準備激酶（致活酶）實驗時，不要加去氧膽酸鈉，因為離子型去污劑能夠使酶變性，導致活性喪失。 RIPA蛋白酶抑制劑 苯甲基磺酰氟（PMSF）（用異丙醇配制成200mM的儲存液，室溫保存） EDTA（鈣螯合劑；用H2O配制成100mM的儲存液，PH 7.4） 亮抑酶肽（Leupeptin）（用H2O配制成1mg/ml的儲存液，分裝，-20℃保存） 抑蛋白酶肽（Aprotinin）（用H2O配制成1mg/ml的儲存液，分裝，-20℃保存） 胃蛋白酶抑制劑（Pepstatin）（用甲醇配制成1mg/ml的儲存液，分裝，-20℃保存）