非同位素原位雜交組化與免疫組化聯合法實驗步驟

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步驟如下：

　　（1）將切片漂浮于能經受高壓滅菌的器皿中。0.1mol/l PBS pH7.2沖洗3×5min。 　　（2）0.1mol/L甘氨酸PBS 沖洗5min。 　　（3）0.4% Triton X-100 PBS 15min。 　　（4）1μg./ml蛋白酶K（0.1mol/l Tris –HCl pH8.0, 50mmol/L EDTA 配），37℃保溫30min。 　　（5）4%多聚甲醛PBS 5min。 　　（6）PBS沖洗2×min。 　　（7）0.25%乙酸酐（0.1mol/L三乙醇胺配）10min。 　　（8）2×SSC沖洗10min。 　　（9）將切片用滅菌吸水紙吸干，然后入雜交液。核酸探針濃度為0.25～0.5μg./ml。每一正常成年大鼠腦冠狀切片15μl雜交液足夠。43℃保溫12～16h。 　　（10）4×SSc 37℃沖洗30min。 　　（11）2×SSC（含RNasea 20μg/ml）37℃保溫30min。 　　（12）1×SSC和0.5×SSc 37℃分別沖洗30min。 　　（13）0.05mol/l PBS沖洗3×5min。 　　（14）0.5%H2O2 PBS室溫20min。 　　（15）0.05mol/l PBS 沖洗2×5min。 　　（16）堿性磷酸酶標記抗地高辛抗體（Fab）與抗蛋白或多肽等抗體混合液，前者一般1：1000稀釋，后者則因抗體而異。稀釋液：1%BSA，0.4%Triton X-100 ,0.05mol/L PBS pH7.2，4℃孵育24h。 　　（17）0.05mol/l PBS沖洗4×5min。 　　（18）二抗（1：100～1：200）37℃保溫1h。 　　（19）0.05mol/l PBS沖洗3×5min。 　　（20）PAP（1：200～1：400）37℃保溫1h。 　　（21）0.05mol/l PBS沖洗3×5min。 　　（22）DAB顯色液（0.05%DAB + 0.03% H2O2,0.05mol/L PBS pH7.2配）顯色5～10min。 　　（23）0.05mol/l PBS沖洗3×5min。 　　（24）TSM，沖洗2×5min（TSM1：0.1mol/l Tris – HCl pH8.0,0.1mol/L NaCl,0.01mol/L MgCl2）. 　　（25）硝基四氮唑藍（400μg/ml）和5-溴-4-3-吲哚磷酸（200μg/ml）混合液（TSM2配顯色混合液）顯色1～3h，避光。 　　（26）20mmol/l EDTA終止顯色。 　　（27）將切片貼于涂有鉻礬明膠的載片上，空氣干燥。 　　（28）梯度酒精脫水，透明、封片。