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第二節　基因治療 Gene Therapy

　　許多疾病如遺傳性疾病、腫瘤等與人體的基因異常有密切的因果關系。早在DNA重組技術之前就有人提出將正常基因順序導入病人體內進行基因水平治療的設想。Edward Tatum 和Joshua Lederberg 在60年低曾提出可利用病毒作為基因轉移的 載體 。但直到1990年才成功地實現了用基因治療手段嘗試治療腺苷酸脫氨酶缺乏癥（adenosine deaminase deficiency）。到目前為止，已報道的基因治療方案已超過百種。有300多病人接受了這種新的治療方式。基因治療的對象不再局限于遺傳病，而被擴展到腫瘤和傳染病等多種疾病。其發展相當迅速，前景十分看好，我國學者也在用基因治療方式治療血友病方面做了一定工作。目前已積累了一定的經驗和教訓，有了一些可遵循的操作程序及可供選擇的治療方式。但這種新的治療方式仍有許多環節需要不斷改進和提高。

一、基因治療的概念和策略

基因治療(gene therapy)就是用正常或野生型(wild type)基因較正或置換致病基因的一種治療方法。在這種治療方法中，目的基因被導入到靶細胞（target cells）內，他們或與宿主細胞（host cell）染色體整合成為宿主遺傳物質的一部分，或不與染色體整合而位于染色體外，但都能在細胞中得到表達，起到治療疾病的作用。

目前基因治療的概念了較大的擴展，凡是采用分子生物學的方法和原理，在核酸水平上開展的疾病治療方法都可稱為基因治療。隨著對疾病本質的深入了解和新的分子生物學方法的不斷涌現，基因治療方法有了較大的發展。根據所采用的方法不同，基因治療的策略大致可分為以下幾種：

基因置換（gene replacement）：基因置換就是用正常的基因原位替換病變細胞內的致病基因，使細胞內的DNA完全恢復正常狀態。這種治療方法最為理想，但目前由于技術原因尚難達到。

基因修復（gene correction）：基因修復是指將致病基因的突變堿基序列糾正，而正常部分予以保留。這種基因治療方式最后也能使致病基因得到完全恢復，操作上要求高，實踐中有一定難度。

基因修飾（gene augmentation）又稱基因增補，將目的基因導入病變細胞或其它細胞，目的基因的表達產物能修飾缺陷細胞的功能或使原有的某些功能得以加強。在這種治療方法中，缺陷基因仍然存在于細胞內，目前基因治療多采用這種方式。如將組織型纖溶酶原激活劑的基因導入血管內皮細胞并得以表達后，防止經皮冠狀動脈成形術誘發的血檢形成。

基因失活（gene inactivation）：利用反義技術能特異地封閉基因表達特性，抑制一些有害基因的表達，已達到治療疾病的目的。如利用反義RNA、核酶或肽核酸等抑制一些癌基因的表達，抑制腫瘤細胞的增殖，誘導腫瘤細胞的分化。用此技術還可封閉腫瘤細胞的耐藥基因的表達，增加化療效果。

免疫調節（immune adjustment）：將抗體、抗原或細胞因子的基因導入疾人體內，改變病人免疫狀態，達到預防和治療疾病的目的。如將白細胞介素-2導入腫瘤病人體內，提高病人IL-2的水平，激活體內免疫系統的抗腫瘤活性，達到防治腫瘤復發的目的。

其它：增加腫瘤細胞對放療或化療的敏感性：采用給予前體藥物的方法減少化療藥物對正常細胞的損用力。如向腫瘤細胞中導入單純皰疹病毒胸苷激酶基因，然后給予病人無毒性GCV藥物，由于只有含HSV-TK基因的細胞才能將CGV轉化成有毒的藥物。因而腫瘤細胞被殺死，而對正常細胞無影響。

總之，基因治療的策略較多，不同的方法在實踐中各具有優缺點。而基因的治療本身也并不局限于遺傳病的治療，現已擴展到腫瘤、病毒性疾病等。基因治療可用于疾病的治療，也可用于疾病的預防。應該指出的是基因治療并不是萬能的，尚不能取代現有的治療方法，作為一種新的方法也還有一些需進一步完善的地方，在實踐是應相互結合，取長補短，以取得較好的治療效果。

一些常見疾病的治療策略見表1。

表23-1 基因治療策略

遺傳性疾病 --隱性遺傳病

--用正常基因置換致病基因而達到完全校正

--導入正常基因序列以達到暫時性校正

--顯性遺傳病

--用正常基因置換致病基因而達到完全校正

--使有害基因失活而達到暫時性校正（如用反義技術、核酶等）

--在某些情況下可導入正常基因加以校正（如LDL受體） 腫瘤 --殺傷腫瘤細胞（如利用自殺基因，激活免疫系統及保護正常細胞免受化療藥物的損傷等）

--使癌基因失活（反義技術、核酶）或增加抑癌基因的表達 偉染病 --殺傷傳染源（免疫法、自殺基因）

--使傳染源失活（反義技術、核酶、核酸陷井） 其它疾病 --導入藥物基因（藥物釋放）如激素、細胞因子

--失活有害基因產物（反義技術、核酶、核酸陷井）

--殺傷策略如減少特異細胞群

二、基因治療的基本程序

基因治療是在基因工程基礎上發展起來的分子生物學技術，它相對于現有其它治療方法較為復雜。基因治療的基本過程包括以下主要方面：

（一）目的基因的選擇和制備

　　基因治療的首要問題是選擇用于治療疾病的目的基因。對遺傳病而言只要已經研究清楚某種疾病的發生是由于某個基因的異常所引起的，其野生型基因就可被用于基因治療，如用ADA基因治療ADA缺陷病。但在現在的條件下，僅此是不夠的。可用于基因治療的基因需滿足以下幾點：在體內僅有少量的表達就可顯著改善癥狀；該基因的過高表達不會對機體造成危害。很顯然某些激素類基因如與血糖濃度相關的胰島素基因目前尚不能用于 糖尿病 的基因治療。在抗病毒和病原體的基因治療中。所選擇的靶基因應在病毒和病原體的生活史和起重要的作用并且該序列是特異的，如針對HBV的HBeAg或X基因等。腫瘤病人多有免疫缺陷，可選用免疫因子基因轉入人體，腫瘤細胞內往往存在多種基因異常形式，可采用反義技術封閉細胞內活化的癌基因或向細胞內轉入野生型抑癌基因，抑制腫瘤生簪，所針對的癌基因或抑癌基因應下該腫瘤的發生和發展有明確的相關性。

　　在確定欲選目的基因后，就在制備目的基因。正向表達的基因可以是cDNA（complementary DNA），也可是 基因組 DNA(genomic DNA)片段。可用傳統的方法獲取，也可采用多聚酶鏈式反應(polymerase chain reaction PCR)等新技術進行體外擴增。部分反義基因也可采用此法獲得，但多數情況下采用人工合成的方式制備。

（二）基因的轉運

　　目前已有多種基因轉運的方式，其基本原則是將外源基因運到細胞內。已使用的有病毒 載體 和非病毒 載體 兩大類。

病毒載體：病毒具有一些獨特的性質如多數病毒可感染特異的細胞，在細胞內不易降解；RNA病毒能整合到染色體以及基因水平較高等。因此病毒載體是良好的基因轉運載體。目前已被用作載體的病毒有逆轉錄病毒、腺病毒、腺相關的病毒。皰疹病毒和肝炎病毒等。逆轉錄病毒用作載體時需進行幾步改造：（1）將天然的野生型RNA前病毒轉變成DNA載體，并插入欲轉移的相關外源基因。其基本原則是用標記基因和外源基因替代病毒的編碼基因，如圖23-2所示。（2）制備輔助細胞為載體DNA提供其喪失的功能，如圖23-3所示。（3）將載體DNA導入輔助以產生病毒載體。如圖23-4。（4）病毒載體感染靶細胞，外源基因在細胞內得以表達，如圖23-5所示。

STEP 1

INSERTING FOREIGN DNA INTO THE RETROVIRAL PROVIRUS

Wild-Type Provirus

圖23-2 Scientists use recombinant DNA techniques to replace the gag,pol,and env genes with one or more foreign genes.The foreign genes can be in

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