原位雜交法測定TNF的mRNA

原位雜交法測定TNF的mRNA ? 原位雜交 【試劑及配制】 （1）???????? TNF-DNA探針 （2）???????? 地高辛標記液試劑盒 （3）???????? 雜交液：60%去離子甲酰胺，300mmol/L NaCl、30mmol/L檸檬酸鈉、10mmol/L EDTA 25mmol/L NaH2 PO4 (pH7.4)，5%葡聚糖硫酸酯，250μg/μl變性鮭精DNA （4）???????? 設備：溫箱，水浴鍋，加樣器，吸頭，染色缸等 【操作步驟】 （1）???????? 用地高辛標記DNA探針，參見上面介紹的“斑點雜交法測定培養細胞IL-2 mRNA的含量”； （2）???????? 準備雜交液； （3）???????? 臨用前，將DIG標記的DNA探針在80℃加熱10分鐘，迅速置冰浴中變性后，將其加入雜交液中，至終濃度5μg/μl； （4）???????? 將10-20μl雜交混合液（雜交液加變性探針）加入到固定并增加了通透性的細胞上，蓋上專用原位雜交蓋玻片，放入盛有約20ml 20%甘油濕盒內37℃使其雜交過液。 洗滌 【試劑及配制】 （1）???????? 2×SSC：1000ml蒸餾水中加氯化鈉17.6g，檸檬酸三鈉（C6 H5 O7 NA3 ?2H2 O，分子量294）8.8g； （2）???????? 0.5×SSC：300ml蒸餾水加100ml 2×SSC即可； （3）???????? 0.2×SSC：270ml蒸餾水加30ml 2×SSC即可 【操作步驟】 ??? 揭掉蓋玻片，30-37℃左右水溫的2×SSC洗滌5min×2次，0.5×SSC洗滌15min×1次，0.2×SSC洗滌15min×1次。 熒光抗體檢測 【試劑及配制】 （1）???????? 封閉液：Tris-HCl 100mmol/L PH7.5，NaCl 150mmol/L，0.5%羊血清。 （2）???????? 抗DIG-熒光素抗體 （3）???????? 洗滌液：0.1M，pH7.2～7.4PBS。 （4）???????? 20%甘油：20ml甘油加80ml蒸餾水即可。 （5）???????? 乙醇：70%? 90%? 100% （6）???????? 防退色溶液：九份甘油與一份染液（1mmol/L Tris-HCl pH7.5，2% 1.4-diaza-bicyclo[2，2，2]-Octane，500ng/ml propidiumiodide） （7）???????? 地高辛標記和檢測試劑盒 （8）???????? 設備：加樣器，吸頭，染色缸等 【操作步驟】 （1）???????? 每塊載玻中上加100μl封閉液，封閉非特異性結合位點； （2）???????? 用封閉液將抗DIG-熒光素抗體按1：500稀釋加在載玻片上，置濕盒內37℃溫育45min，用洗滌液洗5min×4次； （3）???????? 用100mol/L Tris-HCl（pH7.5），150mmol/L NaCl，0.05% Tween 20洗載玻片； （4）???????? 將細胞樣品依次在70%，90%，100%乙醇浸泡5分鐘，脫水； （5）???????? 將玻片在空氣中干燥； （6）???????? 將細胞樣品放在防退色溶液中，取出封片。 結果觀察 ?????? 表達TNF mRNA的細胞胞漿著色，在熒光顯微鏡熒光的分布與強渡。