陽性克隆的篩選(panning)

一個篩選實驗包括數輪識別和復制過程。在每一輪中，特異性結合的克隆被選擇和擴增。這些克隆在大約3～5輪之后便可居于多數。每輪的富集系數約為102～103，因此，3輪之后一個特異結合克隆將富集106～109倍。

材料和試劑

1. ELISA板

2. 濕盒

3. 0.1mol/L Na2CO3(pH8.6)

4. 3%BSA

5. TBST

操作步驟

1. 識別

① 用25μl抗原(0.1～1μg/孔)于4℃包被ELISA板過夜。抗原溶解于0.1mol/L Na2CO3(pH8.6)中。

② 甩去孔中液體，用去離子水洗滌2次。

③ 用3%BSA封閉,隔絕空氣或置于潮濕的容器中溫育。

④ 37℃1h后，甩去液體。

⑤ 每孔加入50μl噬菌體懸液(共1012pfu)。

⑥ 封好孔置于濕盒中，37℃ 2h。

⑦ 去掉噬菌體，加滿TBS/0.5% Tween 20(TBST)，劇烈上下吹打。放置5min，去掉TBST。在第一輪中用TBST洗1次，第二輪洗5次，以后各洗10次。

⑧ 每孔加入50μl洗脫緩沖液(0.1mol/L HCl，用甘氨酸調pH至2.2/BSA 1mg/ml)。室溫放置10min，劇烈地反復吹打。轉移洗脫液至離心管內，用3μl 2mol/L Tris中和。也可用適當濃度的篩選抗原競爭洗脫。

2. 復制

① 用洗脫液感染2μl新鮮TG1(OD600=1),室溫下溫育15min。

② 加入10ml 37℃的SB(含20μg/ml Amp)，立即取10μl、1μl涂布LB平板(含100μg/ml Amp)。將此培養物37℃振蕩培養1h。

③ 將Amp補加至50μg/ml，37℃培養1h。

④ 加入輔助噬菌體M13KO7共1012pfu，一般為1ml。

⑤ 轉移至100μl SB中，Amp為50μg/ml，37℃培養2h。

⑥ 加入卡那霉素至終濃度70μg/ml，37℃培養過夜。

⑦ 4000r/min離心(4℃)15min，轉移上清并按前面步驟提取噬菌體。然后進行下一輪篩選。

測定噬菌體懸液滴度時，應取1μl懸液稀釋至10-3、10-6、10-8，加入50μl新鮮的TG1細胞(OD600=0.5)，室溫下感染15min，涂布于LB平板(含100μg/ml Amp)上