熒光免疫測定

　　一、時間分辨熒光免疫測定 　　以常用熒光素作為標記物的熒光免疫測定往往受血清成分、試管、儀器組件等的本底熒光干擾，以及激發光源的雜射光的影響，使靈敏度受到很大限制。時間分辨熒光免疫測定（timeresolvedfluorescenceimmunoassay，TR-FIA）是針對這缺點加以改進的一種新型檢測技術。其基本原理是以鑭系元素銪（Eu）螯合物作熒光標記物，利用這類熒光物質有長熒光壽命的特點，延長熒光測量時間，待短壽命的自然本底熒光完全衰退后再行測定，所得信號完全為長壽命鑭系螯合物的熒光，從而有效地消除非特異性本底熒光的干擾。TR-FIA的測定原理見圖17-4。以雙抗體夾心法為例的測定反應程序見圖17-5。其中增強液的作用是使熒光信號增強。因為免疫反應完成后，生成的抗原－抗體－銪標記物復合物在弱堿性溶液中，經激發后所產生的熒光信號甚弱。在增強液中可至pH2～3，銪離子很容易解離出來，并與增強液中的β-二酮體生成帶有強烈熒光的新的銪螯合物，大大有利于熒光測量。 圖17-4 TR-FIA測定原理示意圖 圖17-5 雙抗體夾心法TR-FIA反應程序示意圖 　　所用檢測儀器為時間分辨熒光計，與一般的熒光分光光度計不同，采用脈沖光源（每秒閃爍1000次的氙燈），照射樣品后即短暫熄滅，以電子設備控制延緩時間，待非特異本底熒光衰退后，再測定樣品發出的長鑭系熒光。檢測靈敏度可達0.2～1ng/ml。 　　二、熒光偏振免疫測定 　　熒光物質經單一平面的偏振光藍光（波長485nm）照射后，可吸收光能躍入激發態；在恢復至基態時，釋放能量并發出單一平面的偏振熒光（波長525nm）。偏振熒光的強度與熒光物質受激發時分子轉動的速度成反比。大分子物質旋轉慢，發出的偏振熒光強；小分子物質旋轉快，其偏振熒光弱。利用這一現象建立了熒光偏振免疫測定（floutescencepolarizationimmunoassay，FPIA），用于小分子物質特別是藥物的測定。 　　FPIA的 試劑 為熒光素標記的藥物和抗藥物的 抗體 ，模式為均相競爭法，標本中的藥物與熒光標記的藥物與一定量的 抗體 競爭結合。反應平衡后，與抗體結合的熒光標記藥物的量與標本中藥物濃度的量呈反比。由于抗體的分子量遠大于藥物的分子量，游離的熒光標記藥物與結合抗體的熒光標記藥物所產生的偏振熒光強度相差甚遠。因此在FPIA中測定的偏振熒光強度與標本中藥物的濃度呈反比。