免疫組化雙抗染色實驗流程

相關專題 如何實現完美的免疫組化實驗

一、脫蠟和水化

方法同SP法。

二、第一抗體的染色

1、將切片浸在3%H2O2甲醇溶液(新鮮配制)中10min，PBS 沖洗3min×3次;

2、加100ul(2滴)血清封閉溶液(試劑1)到切片上，室溫孵育10min，倒掉(不能沖洗);

3、加入一抗(按照說明書推薦濃度和孵育條件);

4、使用含有0.05%吐溫20的PBS(TPBS)，沖洗5min×3次;

5、加入100ul(2滴)生物素化的二抗(試劑2)，室溫孵育10min;

6、用TPBS沖洗5min×3次;

7、加入100ul(2滴)鏈霉親和素-AP(試劑3)的二抗，室溫孵育10min;

8、用TPBS沖洗5min×3次;

9、準備底物溶液：將1滴試劑4A和4B加入到1ml去離子水 中，充分混勻。再加入1滴試劑4C，充分混勻;

10、加100ul(2滴)配好的AP底物溶液，室溫孵育(鏡下掌握孵育時間);

11、使用含有0.05%吐溫20的去離子水沖洗終止反應。

三、第二抗體的染色

12、加100ul(2滴)雙染增強劑(試劑7)，孵育;

13、用TPBS沖洗3min×3次;

14、加100ul(2滴)血清封閉溶液(試劑1)到切片上，室溫孵育10min，倒掉(不能沖洗);

15、加入稀釋好的一抗(按照說明推薦濃度和孵育條件);

16、用TPBS沖洗5min×3次;

17、加入100ul(2滴)生物素化的二抗(試劑2)，室溫孵育10min;

18、用TPBS沖洗5 min×3次;

19、加入100ul(2滴)鏈霉親和素-HRP(試劑5)的二抗，室溫孵育10min;

20、用TPBS沖洗5min×3次;

21、 準備底物溶液：將1滴試劑6A和6B加入到1ml去離子水中，充分混勻。再加入1滴試劑6C，充分混勻;

22、 加100ul(2滴)配好的HRP底物溶液，室溫孵育(鏡下掌握孵育時間);

23、 使用含有0.05%吐溫20的去離子水沖洗終止反應;

24、 使用復染試劑染色(根據需要選擇);

25、 封片劑(試劑8)封片，顯微鏡觀察并拍照。