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第四篇 免疫學的臨床應用

第二十章　免疫學檢測法

　　免疫學檢測技術的用途非常廣泛，它們可用于有關免疫疾病的診斷、療效評價及發病機制的研究。如對傳染病、免疫增殖性疾病、免疫缺損病、超敏反應、 自身免疫 病、移植排斥反應腫瘤的免疫學檢測，對診斷、治療均有很大幫助。此外在醫學生物學研究中對抗原性物質或細胞的定性、定量檢查不僅推動了對各種免疫學現象的研究，而且擴大免疫學與醫學生物許多領域的聯系。本章僅介紹常用免疫學檢測方法的原理，簡要過程和實用意義。

第一節　抗原或抗體的檢測

一、檢測的原理

借助抗原和抗體在體外特異結合后出現的各種現象，對樣品中的抗原或抗體進行定性、定量、定位的檢測。

1．抗原與抗體的親和力(affinity)抗原抗體的結合就像酶與底物的結合，激素與其受體的結合一樣不是化學的反應，而是非共價鍵的可逆的結合。抗原決定簇和抗體分子可變區互補構型，造成兩分子間有較強的親和力。空間構型互補程度不同，抗原和抗體分子之間結合力強弱也不同。互補程度高，則親和力強。此外，反應溫度、酸堿度和離子濃度對抗原和抗體分子上各基因的解離性和電荷特性也有重要的影響，抗體與抗原決定簇之間的結合力大小可用親合力來表示。高親合力的抗體與抗原的結合力強，即使抗原濃度很低時也有較多的抗體結合抗原形成免疫復合物。

2．抗原或抗體外檢測原理根據抗原抗體結合形成免疫復合物的性狀與活性特點，對標本中的抗原或抗體進行定性、定位或定量的檢測。定性和定位檢測比較簡單，即用已知的抗體和待檢樣品混合，經過一段時間，若有免疫復合物形成的現象發生，就說明待檢樣品中有相應的抗原存在。若無預期的現象發生，則說明樣品中無相應的抗原存在。同理也可用已知的抗原檢測樣品中是否有相應抗體。

對抗原或抗體進行定量檢測時，以反應中加入抗原和抗體的濃度與形成免疫復物的濃度呈函數關系。

（1）根據免疫復合物產生的多少來推算樣品中抗原（或抗體）的含量：在一定的反應條件下，加入的已知抗體（或抗原）的濃度一定，反應產生的免疫復合物多少與待檢樣品中含有相應抗原（或抗體）量成正比。也就是抗體濃度一定時，免疫復合物越多則樣品中的抗原量也越多。可用實驗性標準曲線推算出樣品中抗原（或抗體）的含量。如免疫單向擴散試驗、免疫比濁試驗和酶聯免疫檢測等都屬于這類方法。

（2）抗原或抗體效價滴定的原理：當抗原抗體復合物形成多少不能反應抗原抗體反應強弱時，就不能以檢測反應強度來對抗原或抗體進行定量。在實際工作中，把濃度低的反應成分（抗原或抗體）的濃度固定，把濃度高的另一種反應成分作一系列稀釋。例如用人血清作抗原免疫3只家兔，比較3只家兔產生抗體的多少，即滴定3只兔血清抗體效價，可用雙向瓊脂擴散法來滴定，例如將抗體濃度固定，將抗原作不同的稀釋度，分別將抗原或抗體滴入瓊脂的相應小孔中，觀察免疫兔血清與不同稀釋度的抗原出現明顯沉淀淺的抗原稀釋度（如甲兔的抗體效價為1/2000，而丙免的是1/8000則可比較出后者比前者產生抗體的效價要高）。也就是表示效價的稀釋度越高，樣品中所含待檢成分越多。因人血清（抗原）和抗體（免疫兔血清）相比，濃度高，故應稀釋抗原。

二、抗原或抗體檢測的實用意義

1．抗體檢測的意義檢測抗體可用于評價人和動物免疫功能的指標。抗體用于臨床治療或實驗研究時也需做純度分析和定量測定。臨床上檢測病人的抗病原生物的抗體、抗過敏原的抗體、抗HLA抗原的抗體、血型抗體及各種自身抗體，對有關疾病的診斷有重要意義。

2．抗原檢測的意義可做為抗原進行檢測的物質可分為以下四類：

（1）各種微生物及其大分子產物：用于傳染病診斷、微生物的分類及鑒定以及對菌苗、疫苗的研究。

（2）生物體內各種大分子物質：包括各種血清蛋白（如各類免疫球蛋白、補體的各種成分）、可溶性血型物質、多肽類激素、細胞因子及癌胚抗原等均可做為抗原進行檢測。在對這些成分的生物學作用的研究以及各種疾病的診斷有重要意義。

（3）人和動物細胞的表面分子：包括細胞表面各種分化抗原（如CD抗原）、同種異型抗原（血型抗原或MHC抗原）、病毒相關抗原和腫瘤相關性情抗原等。檢測這些抗原對各種細胞的分類、分化過程及功能研究、對各種與免疫有關的疾病的診斷及發病機制的研究，均有重要意義。

　　（4）各種半抗原物質：某些藥物、激素和炎癥介質等屬于小分子的半抗原，可以分別將它們偶聯到大分子的 載體 上，組成人工結合的完全抗原。用其免疫動物，制備出各種半抗原的抗體，應用于各種半抗原物質的檢測，例如對某些病人在服用藥物后進行血中藥物濃度的監測。對運動員進行服用違禁藥品的檢測，都是應用半抗原檢測的方法。

三、抗原或抗體檢測的方法

由于各種檢測方法中所用的抗原性狀不同，出現結果的現象也不同。最廣泛應用方法有下述幾種：

（一）沉淀反應

可溶性抗原與抗體結合，在兩者比例合適時，可形成較大的不溶性免疫復合物。在反應體系中出現不透明的沉淀物，這種抗原抗體反應稱為沉淀反應（precipitation neaction）。

1．環狀沉淀試驗　　先將含抗體的未稀釋的免疫血清加到直徑小于0.5cm的小試管底部。將稀釋的含有可溶性抗原的材料重疊于上，讓抗原與抗體在兩液體的界面相遇，形成白色免疫復合物沉淀環，故名為環狀沉淀試驗（ring precipitationtest）,此法簡便易行，需用材料較多是其缺點。

2．單向免疫擴散試驗　　單向免疫擴散試驗（single immunodiffusion）是在凝膠中進行的沉淀反應。將抗體混入加熱溶解的瓊脂中，傾注于玻片上，制成含有抗體的瓊脂板，在適當位置打孔，將抗原材料加入瓊脂板的小孔內，讓抗原從小孔向四周的瓊脂中擴散，與瓊脂中的抗體相遇形成免疫復合物。當復合物體積增加到一定程度時停止擴散，出現以小孔為中心的圓形沉淀圈，沉淀圈的直徑與加入的抗原濃度成正相關。本方法簡便，易于觀察結果，可測定抗原的靈敏度（最低濃度）約為10～20μg/ml，常用于定量測定人或動物血清IgG、IgM、IgA和C3等，其缺點是需1～2天才能看結果（圖20-1）

圖20-1 單向免疫擴散試驗示意圖

3．免疫比濁法　 當抗體濃度高，加入少量可溶性抗原，即可形成一些肉眼看不見的小免疫復合物，它可使通過液體的光束發生散射，隨著加入抗原增多，形成的免疫復合物也增多，光散射現象也相應加強。免疫比濁法（immunonephelomytry）就是在一定的抗體濃度下，加入一定體積的樣品，經過一段時間，用光散射濁度計（nephelometry）測量反應液體的濁度，來推算樣品中的抗原含量。本法敏感、快速簡便，可取代單向擴散法定量測定免疫球蛋白的濃度。

4，雙向免疫擴散試驗　 雙免疫擴散試驗（double immunodiffusion）是在瓊脂板上按一定距離打數個小孔，在相鄰的兩孔內分別放入抗原和抗體材料。當抗原和抗體向四周凝膠中擴散，在兩孔間可出現2～3條沉淀線，本法常用于抗原或抗體的定性或定量檢測，或用于兩種抗原材料的抗原相關性分析（圖20-2）。

圖20-2 雙向免疫擴散試驗示意圖

5．對流免疫電泳　對流電泳（counterimmunoelectrophoresis）是一敏感快速的檢測方法，即在電場作用下的雙向免疫擴散。將瓊脂板放入電泳槽內，使瓊脂板的兩孔沿著電場的方向，于負極側的孔內加入抗原，于正極側的孔內加入抗體，通電后，抗原帶負電荷向正極泳動，抗體分子雖也帶負電荷，但因分子量大，向正極的位移小，而受瓊脂中電滲作用向負極移動，抗原和抗體能較快地集中在兩孔之間的瓊脂中形成免疫復合物的沉淀線。只需1小時左右即可觀察結果。

6．免疫電泳　 免疫電泳(immunoelectrophoresis)的方法分成兩個步驟，即先進行電泳，再進行瓊脂擴散。先將樣品加入瓊脂中電泳，將抗原各成分依電泳速度不同而分散開。然后在適當的位置上沿電泳方向挖一直線形槽，于槽內加入含有針對各種抗原混合抗體液，讓各抗原成分與相應抗體進行雙向免疫擴散，可形成多答卷沉淀線。常用此法進行血清的蛋白種類分析。對于免疫球蛋白缺損或增多的疾病的診斷或鑒別診斷有重要意義（圖20-3）。

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