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  • 實驗方法> 免疫學技術> 抗體抗原實驗>雙抗體夾心ELISA法檢測待測樣品sIL-2R含量

    雙抗體夾心ELISA法檢測待測樣品sIL-2R含量

    關鍵詞: 雙抗體 ELISA 檢測來源: 互聯網

    雙抗體夾心ELISA法檢測待測樣品sIL-2R含量 ? 【基本原理】 選用兩株針對sIL-2R分子不同位點的單克隆抗體,即McAb1 (包被抗體)與McAb2 (酶標抗體)。先用McAb1 包被固相載體,使待測sIL-2R與之特異性結合,然后再加入辣根過氧化物酶(HRP)標記的McAb2 ,則形成McAb1 -sIL-2R-HRP標記McAb2 復合物,再加入HRP底物(鄰苯二胺),則酶催化底物而顯色,測定樣品與標準品OD值,繪制標準曲線,即可從標準曲線中查得待測樣品中sIL-2R含量。該法敏感性高,且特異、簡便、快速、取材容易,故較為常用。 【材料和試劑】 (1)???????? 包被抗體(McAb1 ):使用時用包被液作適當稀釋(如1:100)。 (2)???????? 酶標抗體(McAb2 ):以辣根過氧化物酶(HRP)標記。使用時用稀釋液做 適當稀釋,其稀釋度根據預試驗結果而定。 (3)???????? sIL-2R標準品:已知含量的sIL-2R,使用時用稀釋液作倍比稀釋成7個濃度:1600u/ml, 800u/ml, 400u/ml, 200u/ml, 100u/ml, 50u/ml, 25u/ml (4)???????? 待測樣品:如血清、血漿、尿液、細胞培養上清液等均可用于檢測sIL-2。 (5)???????? 陰性對照品:未免疫小鼠IgG (6)???????? PBS(0.01mol/L, pH7.4的磷酸鹽緩沖液) (7)???????? 包被液(0.05 mol/L, pH9.6的磷酸鹽緩沖液) (8)???????? 稀釋液(含10% BSA的PBS) (9)???????? 洗滌液(0.05% Tween20-PBS) (10)????? 底物緩沖液(0.1 mlo/L, pH5.0的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液) (11)????? HRP底物:鄰苯二胺(OPD) (12)????? 3% H2 O2 (13)????? 底物顯色液(OPD-H2 O2 ):臨用前配制,4℃避光保 (14)????? 終止液(2 mol/L H2 SO4 ) (15)????? 96孔酶標板,酶標測定儀,495nm濾光片 (16)????? 其他:4℃冰箱,水浴箱,刻度吸管,毛細吸管,加樣器及吸頭 【操作步驟】 (1)???????? 包被:將用包被液稀釋好的McAb1 (5-10μg/ml)加入96孔酶標板,100μl/孔,置37℃ 2h后移置4°C過夜(16-72h); (2)???????? 洗滌:將96孔酶標板傾去包被液,用洗滌液加滿各孔,置3min,然后棄去,反復洗滌3次 (3)???????? 加樣(均設雙復孔): ①將已知含量的sIL-2R標準呂用稀釋液作倍比稀釋后,分別加入1-7孔,100μl/孔,按濃度從低到高的順序依次加樣; ②第8孔加入待測樣品,100μl; ③第9孔加陰性對照血清(未免疫小鼠IgG),100μl; ④第10孔為空白對照(稀釋液),100μl; (4)???????? 加樣后,置室溫孵育1-2h; (5)???????? 洗滌3次,方法同前。 (6)???????? 各孔加入HRP標記的McAb2 ,用稀釋液作適當稀釋其稀釋度根據預試驗結果確定,100μl/孔; (7)???????? 置37℃孵育1~2h; (8)???????? 洗滌3次,方法同前; (9)???????? 顯色:各孔加新鮮配制的OPD-H2 O2 顯色液,100μl/孔,置室溫或37℃下避光反應15-30min; (10)????? 終止反應:各孔加2mol/L H2 SO4 ,50μl/孔 (11)????? 測定OD值:用酶標測定儀以波長495nm測定各孔OD值。 【結果判斷】 (1)???????? 空白對照及陰性對照孔應無色,各陽性孔呈現棕黃色,且sIL-2R標準品各孔呈明顯顏色由淺到深梯度改變。 (2)???????? 繪制標準曲線:以標準品各稀釋度sIL-2R含量為橫座標(X),相應的OD值為縱座標(Y),在普通座標紙上繪制標準曲線。 (3)???????? 根據待測樣品孔的OD值,在標準曲線上查得待測樣品sIL-2R含量。 【注意事項】 (1)???????? 血清或血漿中殘存的凝塊或紅細胞須離心去除,勿用溶血或血脂過高的血清檢測sIL-2R。 (2)???????? 待測樣品在4℃可放置一周,如不立即檢測應置于-20℃或-70℃冰箱中,且應避免反復凍融,宜分裝保存。 (3)???????? sIL-2R標準品質量直接影響檢測結果的準確性,應注意商品試劑盒中的sIL-2R標準品可隨時間延長而降低效價。 (4)???????? 疊氮鈉(NaN3 )對辣根過氧化物酶有滅活作用,在本實驗系統中應避免使用。 (5)???????? 底物顯色液應在臨用前配制,4℃避光保存,H2 O2 應置2-8℃,保存6個月以內。加入底物顯色15-30min后應立即測定OD值。 (6)???????? 分別用加樣器頭吸取各份標本,避免相互交叉使用。 (7)???????? 避免孔中有氣泡,以免影響所測OD值的準確性。 (8)???????? 因不同來源的樣品,不同實驗室所測得的sIL-2R含量不同,故sIL-2R正常標準難以統一。可進行大樣本測定,以X+ 2SD確定自己實驗室各種來源檢測樣品的參考值范圍。在臨床觀察中,一般以sIL-2R水平升高有意義,故可設立X+2SD為正常值上限。一般用ELISA法測定血清時,sIL-2R水平<200~300u/ml。

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