人皮質酮 ( Corticosterone )ELISA 試劑盒

原理

本實驗采用雙抗體夾心 ABC-ELISA 法。用抗人 Corticosterone 單抗包被于酶標板上，標準品和樣品中的 Corticosterone與單抗結合，加入生物素化的抗人 Corticosterone ，形成免疫復合物連接在板上，辣根過氧化物酶標記的 Streptavidin 與生物素結合，加入底物工作液顯藍色，最后加終止液硫酸，在 450nm 處測 OD 值，Corticosterone 濃度與 OD 值成正比，可通過繪制標準曲線求出標本中Corticosterone 濃度。

試劑盒組成 （ 2-8 ℃保存）

準備試劑與收集血樣

1. 收集標本：血清、血漿（EDTA ）、細胞培養上清液、組織勻漿等盡早檢測， 2-8 ℃ 保存48 小時；更長時間須冷凍（ -20 ℃或 -70 ℃ ）保存，避免反復凍融。

2. 標準品液配制：使用前加入0.3ml 蒸餾水 混勻，配成 4000 0 p g/ml 的溶液 。 設標準 管 8 管， 每 管加入標本稀釋液 30 0ul 。在第一管中加入 4000 0 p g/ml 的標準品溶液 3 00ul 混勻后用加樣器吸出 3 00ul ，移至第二 管 。如此反復作對倍稀釋，從第七 管 中吸出 3 00ul 棄去。第八 管 為空白對照。

3. 10× 標本稀釋液用蒸餾水作 1: 1 0 倍稀釋（ 示例： 1ml濃稀釋液 +9ml 蒸餾水）。

4. 洗滌液：用重蒸水 1:20 稀釋（示例：1ml 濃縮洗滌液加入 19ml 的重蒸水）

標本激活方法

1. 將450ul 標本稀釋液加入到一支 1.5ml 進口聚丙烯管中 , 再加 10ul 血清或血漿標本。

2. 加20ul 1 N HC I ,蓋緊，上下混勻。 2 － 8 ℃ 放置60± 2 分鐘。

3. 加20ul 1 N NaOH, 蓋緊，上下混勻。

4. 即用，或放-20/-70 ℃ 保存3 天。計算結果時乘 以稀釋倍數 50 。 （ 注意：不同的標本Corticosterone 的水平可能有較大差異，請根據實際情況靈活掌握稀釋度）

5. 細胞培養上清或組織勻漿 10 倍稀釋 (410ul 的標本稀釋液＋ 50ul 樣本＋ 20ul 的 1N HCI+20ul 的 1N NaOH) 。

檢測程序

1. 加樣：每孔各加入標準品或待測樣品（已激活） 100ul ，將反應板充分混勻后置 37 ℃ 120 分鐘。

2. 洗板：用洗滌液將反應板充分洗滌 4-6 次，向濾紙上印干。

3. 每孔中加入第一抗體工作液10 0ul 。將反應板充分混勻后置 37 ℃ 6 0 分鐘。

4. 洗板：同前。

5. 每孔加酶標抗體工作液100ul 。將反應板置 37 ℃ 3 0 分鐘。

6. 洗板：同前。

7. 每孔加入底物工作液100ul ，置 37 ℃ 暗處反應15 分鐘。

8. 每孔加入100ul 終止液混勻。

9. 30分鐘內用酶標儀在 45 0 nm 處測 吸光值。

結果計算與判斷

1. 所有 OD 值都應減除空白值后再行計算。

2. 以標準品20 0 0 0 、1000 0 、5000 、 2500 、 1250 、 625 、 312 、 0 pg /ml 為橫坐標， OD 值為縱坐標，在坐標紙上作圖，畫出標準曲線。

3. 根據樣品 OD 值在該曲線圖上查出相應 Corticosterone 含量 ，再乘上稀釋倍數即可 。

試劑盒性能

1. 靈敏度 ： 最小的Corticosterone 檢測濃度小于 150 pg/ml。

2. 特異性： 可同時檢測重組或天然的人 Corticosterone 。 不與 人其它細胞因子有交叉反應。

3. 重復性：板內、板見變異系數均小于9.6％。

注意事項

1. 以上標準孔及待 測 樣品均建議做復孔，每次測定應同時 做 標準曲線。

2. 洗滌過程 很關鍵。洗滌不充分將導致精確度誤差及 OD 值錯誤地升高。

3. 板條開封后剩余板條要再封好，保持 板條干燥 。

4. 本試劑盒宜置 4 o C冰箱保存。

5. 本試劑盒僅用于科研，不能用于臨床診斷！