免疫熒光染色技術檢測各類免疫細胞的數量

免疫細胞在各自正常分化成熟的不同階段以及活化過程中，其細胞膜表面均表達可供鑒別的特殊結構，即表面標志。其中CD分子常作為各類免疫細胞的表面標志用于免疫細胞的鑒定和分離以及用于檢測在不同狀態下某類免疫細胞數量的變化，能夠反映機體免疫功能狀態，有助于研究某種疾病的發病機制，為疾病的診斷和治療提供依據。

【基本原理】

利用熒光素標記抗人T細胞亞群的單克隆抗體（mAb）直接與人淋巴細胞反應；或用標記有熒光素的羊（或兔）抗鼠IgG作為第二抗體，再借助mAb的介導與人淋巴細胞結合。

在熒光顯微鏡下，結合有熒光素標記抗體的細胞在黑暗背景下發出熒光，凡是呈現特異性熒光的細胞即為陽性細胞，計數陽性細胞，從而確定T細胞各亞群的百分率。上述方法分別稱為直接免疫熒光法和間接免疫熒光法。

【試劑及材料】

（1）肝素鈉溶液:濃度為125～250U/ml。

（2）抗CD3、CD4、CD8的mAb

（3）Hanks液和RPMI-1640營養液

（4）FITC-兔或羊抗鼠IgG

（5） 熒光顯微鏡

【操作方法】

（1） 取肝素抗凝外周血2～5ml，常規方法分離單個核細胞，調整細胞濃度至1.5×106 /ml；

（2） 將淋巴細胞懸液分別加入20孔PVC軟板孔內，每孔100μl，每份標本加4孔。將塑料軟板置吊籃中， 水平離心1000r/min，1min，去上清；

（3） 在1～3孔內分別加入抗 CD3、CD4、CD8的mAb各20μl，第4孔加入1640營養液或無關抗體作為陰性對照；

（4） 將微量軟板置振蕩器上振蕩5s，使淋巴細胞與mAb充分混勻。放入有蓋濕盒內，置4℃ 冰箱中作用45min；

（5） 取出，每孔加入Hanks液200μl，振蕩5s，置吊籃中1000r/min離心1min。甩去上清，振蕩5s，加Hanks液200μl，重復洗滌3次；

（6） 分別加入兔抗鼠IgG熒光抗體各10μl，振蕩5s，放入濕盒內置4 ℃作用45min后，同（4）洗滌3次；

（7） 甩去上清，加入20％甘油PBS緩沖液50～100μl振蕩混勻后，用微量吸液器分別吸取細胞懸液滴至載玻片上，覆以蓋玻片。

【結果觀察】

在熒光顯微鏡下用高倍鏡觀察，分別計數200個淋巴細胞，記錄熒光陽性細胞數（細胞膜上呈現明亮點狀或帽狀黃綠色熒光的細胞），然后分別計算出各淋巴細胞亞群的百分率。