免疫沉淀

免疫沉淀是利用特異性抗體識別并分離抗原的方法。 材料： 上樣buffer的配方(用前現配): 2ul 1.25M Tris-HCL , pH 6.8 35ul distilled water 2.5ul 2-mercaptoethanol 12.5ul 10%SDS 10ul 80% glycerol 2ul bromphenol blue TNE buffer: 10mM Tris-HCl pH 8.0 10mM NaCl 0.5mM EDTA 方法： 1．用含有1% NP40的緩沖液重懸細胞，充分振蕩。 2．在冰上孵育30分鐘或37℃孵育10—15分鐘 3．轉入eppendorf管中離心3分鐘 4．將上清輕輕倒入一干凈試管，加入40—50 ul抗血清 5．冰上孵育2小時或4℃過夜 6．在TNE中加入100ul SPA 和100ul 5% BSA 7．冰上孵育2小時 8．離心使免疫復合物成球，用1ml含1%NP40,0.5% Na deoxychloate, 0.1% SDS 的TNE,在用超聲波重懸 9．加入70ul的上樣緩沖液，振蕩。 10．熱水中水浴90秒，離心1分鐘，保留上清。 11．若不立即實驗請低溫保存。 （以上資料僅供參考） 免疫細胞化學： 1．在無菌消毒的6孔板中加入100，000個/孔細胞，過夜 2．倒掉上清，用PBS洗滌一次后立即加入-20°C的甲醇（注意不要讓細胞干掉），再將板置于-20°C冰箱5分鐘，然后倒掉甲醇加入PHEM 緩沖液，置于4°C。 3．加入含合適血清（2.5—5%）的PHEM 緩沖液輕微振搖一小時 4．加入一抗至封板緩沖液，輕微振搖孵育一小時 5．倒掉封板液，加入PHEM 緩沖液洗滌4次，每次10分鐘 6．加入二抗至封板緩沖液，輕微振搖孵育半小時 7．倒掉封板液，加入PHEM 緩沖液洗滌4次，每次10分鐘 8．用鑷子夾起 coverslip，輕輕去除過多的緩沖液，加入約20ul“antifade”, 輕輕蓋上coverslip, 去掉過多的”antifade” 后置于-20°C避光保存。 試劑 配方： PHEM 緩沖液：: 25 mM HEPES 10 mM EGTA 60 mM PIPES 2 mM MgCl2 pH = 6.9 （請以此順序加入） Antifade: 1 ml 1 mg p-phenylene diamine hydrochloride 溶解在 0.1 ml 10x PBS (20 min 室溫) 加入 0.9 ml 100% 甘油，封閉保存不要振搖。 若顏色變成棕色，請不要用了。分裝保存在-70 °C