利用HLA/抗原肽四聚體和流式細胞分選儀制備CTL細胞克隆 ? ??? 免疫反應的最顯著特點是其特異性，是由于免疫分子與相應的抗原表位結合具有高度特異性。利用免疫反應的特異性，能夠分離出抗原特異性的淋巴細胞克隆。B細胞上BCR（或抗體）能夠直接識別抗原表位，利用某種抗原表位就可以鑒定和分離相應的B細胞克隆（或抗體），過程相對簡單。與B細胞不同，T細胞上TCR識別的配體是抗原肽/MHC分子復合物，而不是天然的抗原表位，因此分離T細胞克隆的過程相對復雜。 ??? 隨著對T細胞識別機制的不斷深入和分子生物學技術的不斷發展，目前已經能夠在體外人工合成TCR結合的配體―HLA抗原肽四聚體（HLA-peptide tetramer）。利用HLA-抗原肽四聚體和流式細胞分選儀能夠從淋巴細胞中分離出抗原特異性的T細胞克隆，結合T 細胞培養，能夠擴增相應的T細胞克隆。該分離特異性T細胞克隆的方法與傳統的細胞培養-有限稀釋法比較，具有操作簡單，克隆效率高等優點。不足之處是需要制備HLA-抗原肽四聚體，并且需要流式細胞分選儀。 【材料和試劑】 （1）外周血淋巴細胞，健康人外周血10-20ml，肝素抗凝，注意供者的HLA型別，可根據研究目的選擇HLA-A2陽性或HLA-A2陰性個體的外周血。 （2）T2細胞株，為TAP缺陷的細胞株，HLA-I類型別為HLA-A*0201，-B*05，-Cw1。因其TAP缺陷，其表達HLA-I類分子的抗原肽結合槽未結合抗原肽，能夠與加入的外源性抗原肽結合，形成HLA-I-抗原肽復合物，能夠被相應的T細胞克隆所識別。 （3）抗原肽，8-10氨基酸殘基長度的短肽，通常采用人工合成的方法制備。其氨基酸的組成與順序是由研究目的（即T細胞克隆的特異性）決定 ???? 抗原肽致敏T2細胞：用無血清培養液調T2細胞濃度至1X106 個細胞/ml，取上述濃度T2細胞懸液1ml，加入10uM抗原肽，混勻后置室溫作用4小時后，用RPMI1640洗滌。 （4）HLA-抗原肽四聚體，制備和使用詳見本章第二節。 （5）伺養細胞，取供者自身PBL，經30Gy射線滅活。 含10%AB血型人血清的RPMI1640培養基 （6）IL-2以及細胞培養所需的試劑和設備 （7）流式細胞分選儀 【操作步驟】 （1）取抗凝外周血10-20ml，用Ficoll-Hypaque密度剃度離心法分離出淋巴細胞，用RPMI洗滌2次。 （2）取1X106 個經抗原肽致敏的T2細胞，用200Gy射線滅活，與步驟（1）分離的淋巴細胞混合，培養液為含10%AB血型人血清的RPMI1640培養基，置37℃，5％CO2 培養5天。 （3）培養5天后，半量更換培養液，并加入IL-2，終濃度為20U/ml。 （4）培養10天后，取1X106 個經抗原肽致敏并經射線滅活的T2細胞，用上述含IL-2的培養液重懸，繼續培養5天，并注意觀察細胞的生長和增殖情況。 （5）當細胞明顯增殖時，可以用流式細胞分選儀和HLA-抗原肽四聚體進行特異性T細胞克隆分選，分選出HLA-抗原肽四聚體特異性的T細胞，用上述含IL-2的培養液重懸，并以1個細胞/孔的濃度加入96孔培養板中。培養板中每孔含2X104 個抗原肽致敏并經射線滅活的T2細胞作為刺激細胞，以及4X104 個經射線（30Gy）滅活的自身PBL作為伺養細胞。 （6）按照上述的培養條件繼續培養，每周半量更換培養液，換液時加入用上述含IL-2培養液重懸的抗原肽致敏并經射線滅活的T2細胞（2X104 /孔）。 （7）如果培養孔中的T細胞（即CTL）能夠特異性識別HLA-抗原肽復合物（例如T2細胞的HLA-A2與加入的抗原肽形成的HLA-抗原肽復合物），該孔的CTL克隆將會發生擴增。 （8）用抗原肽致敏的T2細胞（或者根據研究目的，采用表達相同HLA-I分子以及相同抗原肽的其他細胞）作為靶細胞，用標準的細胞毒實驗（例如51 Cr釋放試驗）對擴增的CTL克隆進行功能鑒定。 （9）對于功能良好的CTL克隆，可以用于T細胞的功能研究或置液氮中保存。 【注意事項】 （1）在靜止T細胞中，抗原特異性T細胞的數量極低，約占靜止T細胞數量的10-4 ~10-6 。在抗原致敏的個體中，抗原特異性T細胞的數量將會增高。因此，在抗原致敏個體的外周血中克隆相應抗原特異性T細胞效率較高。 （2）TCR識別的配體是HLA-抗原肽復合物，在用HLA-抗原肽四聚體分離特異性T細胞克隆時，特別注意HLA型別，要求HLA-抗原肽四聚體與刺激細胞（抗原提呈細胞）的HLA型別相同。 （3）在使用細胞分選儀分選T細胞之前，IL-2的量不宜過高，以免發生非特異性增殖。 （4）上述實驗方法利用T2細胞作為抗原提呈細胞，根據研究目的也可以選用其他細胞作為抗原提呈細胞，此時應注意根據該細胞的HLA型別和所提呈的抗原肽設計和制備HLA-抗原肽四聚體。