酵母雙雜交實驗技幣和其他雙成分系統

酵母雙雜交實驗技幣和其他雙成分系統 ? ??? 酵母 雙雜交系統是以真核細胞轉錄激活因子的結構和活性特點為基礎。真核細胞轉錄激活因子的結構都基本相似，由一個DNA結合結構域(BD)和一個轉錄激活結構域(AD)組成，如酵母蛋白GAL4，這兩個結構域相互獨立但功能上有相互依賴，它們之間只有通過某種方式結合在一起才有完整的轉錄激活因子活性。根據這一特點建立了酵母雙雜交系統。具體實驗步驟如下。 ? ??? 1．第一階段(誘餌―LexA融合蛋白的鑒定) ??? 1)誘餌―LexA融合蛋白的構建 ??? (1)將編碼誘餌蛋白的靶DNA克隆到LexA融合載體的多聚接頭處，以合成一種框架內的LexA融合基因。確定誘餌序列的羧基端存在翻譯終止序列，形成的質粒作為pBait。 ??? (2)采用LexA融合基因和lexAop―lacZ報告質粒的組合，建立一系列EGY48lexAop―LEU2選擇的轉化酵母菌。 ??? (3)將每種轉化混合物鋪在適宜的選擇性缺陷板上，制備轉化子的母板。 ??? 2)活化和抑制活性的鑒定(X―gal和Leu2表型的分析) ??? 3)檢測誘餌蛋白質表達 ??? (1)在母板上，標記要分析蛋白質表達的克隆。用已證實適宜表達誘餌的克隆作為基礎菌培養，供文庫轉化用。 ??? (2)對每個新的誘餌構建，至少分析兩個初級轉化子，還包括兩個作為蛋白質表達陽性對照的轉化子。 ??? (3)為防止可能出現的問題，通過免疫印跡來分析含LexA融合的誘餌的酵母裂解液。 ? ??? 2．第二階段(篩選一個相互作用子) ??? 1)轉化文庫：挑選一個在第一階段的原始對照試驗中狀態最好的表達誘餌蛋白和lexAop―lacZ報告子的酵母菌落，接種于CM(Glu)―Ura―His液體培養基中培養。 ??? 2)初級轉化子的收獲和富集：通過搖動法或刮擦法收獲文庫。 ??? 3)相互作用蛋白的篩選 ??? (1)應用p―半乳糖苷酶活性和亮氨酸需求初步檢測可能發生相互作用的蛋白。 ??? (2)陽性相互作用的二次確定：分離陽性質粒并轉化至大腸桿菌中。通過對含有相同插入片段的陽性克隆制備重復樣品來進行限制性酶切分析，以確定是否重復分離到了小量的cDNA。 ??? (3)陽性相互作用的第三次確定：重復表型和特異性檢測。 ??? (4)應用融合蛋白進行蛋白質印跡來檢測蛋白質―蛋白質相互作用。