酶標記方法

交聯法

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交聯法通常用的交聯劑是戊二醛，戊二醛商品大多為 25% 的水溶液，利用戊二醛分子上對稱的兩個醛基，分別與酶和蛋白質分子中游離的氨基、酚基等以共價鍵結合而進行標記。標記時應盡量采用新鮮純品，當戌二醛的 OD235 nm/OD280 nm ＜ 3 時，即為好的交聯劑。

戊二醛交聯法又分為一步法和二步法。

⑴ 一步法：即把酶、戊二醛和抗體一起加入進行交聯。然后透析出過量的戊二醛而制備出具有高分子量的酶結合物。由于抗體分子量大 (16 萬 ) ，酶分子量小 (4 萬 ), 抗體分子的氨基數比酶蛋白分子氨基數多得多，結果生成的抗體－戊二醛或抗體－戊二醛－抗體多而造成酶標物的活性小。一步法操作：①抗 IgG － AKP 的制備：將 10mgAKP 溶于含有 5mg 抗 IgG 的 1mlPBS(0.01Mol/L pH7.0) 中，在冰浴中緩緩攪拌，盡量避免氣泡產生，完全溶解后，緩緩滴加 1% 戊二醛溶液 4ml ，使戊二醛的最終濃度為 0.2% ，移至室溫中靜置 2h~3h 后，以 0.01Mol/L pH7.0 PBS 液 4 ℃ 充分透析或以 SephadexG25 柱除去過量的戊二醛， 4 ℃ 保存備用 ( 也可保存于 50% 甘油中置低溫冰箱 ) ；②抗 IgG － HRP 的制備：將 12mgHRP 溶于含 5mg 抗 IgG 的 1mlPBS(0.1Mol/L pH6.8) 中 , 緩慢攪拌下加入 1% 戊二醛溶液 4mL ，置室溫 2h~3h ，充分透析或以 SephadexG25 除戊二醛，小量分裝后保存于低溫冰箱，避免反復凍融。或冷凍干燥保存。

⑵ 二步法：是先使酶與戊二醛反應 , 除去未反應的戊二醛，再使已“活化”的酶分子與抗體分子的氨基結合，最后加入少量的賴氨酸封閉被戊二醛激活的酶的殘基。二步法操作：將 10mg 的酶溶于 0.2ml 含 1.25% 戊二醛的 0.1mol/L pH6.8 PBS 中室溫放置 18h ，充分透析或以 SephadexG25 柱除去未反應的戊二醛。加生理鹽水至 1ml 然后加入 1ml( 含 5mg) 的抗體溶液和 1ml 1Mol/L pH9.6 碳酸鹽緩沖液，混合后 4 ℃ 冰箱放置 24h ，加入 0.1ml 0.2mol/L 賴氨酸，置室溫 2h ，以 0.15Mol/L pH7.2 PBS 液充分透析，離心去沉淀，上清液即為酶結合物，再進一步以硫酸銨沉淀純化后應用。 AKP 一般不采用二步法 , 而只用一步法。

改良 HRP 二步標記法：取 HRP10mg 溶于 0.4ml,0.25Mol/L pH6.8PBS 液中或 0.05Mol/L pH9.6 碳酸鹽緩沖液中，加入 25% 戊二醛 0.1ml ， 37 ℃ 溫育 2h 后加入冰冷的分析純的無水乙醇 2ml ， 2 500r/min 離心沉淀 10min~15min ，傾去溶液。沉淀以 80% 乙醇 4ml~5ml 混懸，同上離心，傾去乙醇，將管倒置，使乙醇充分流出。沉淀用 1ml 0.05Mol/L pH9.6 碳酸鹽緩沖液溶解，加入 0.5ml~1ml 抗 IgG 抗體溶液 ( 含抗體 15mg 左右 ) ，放在冰箱內過夜后，加 KH2 PO4 ，使近中性即可應用。

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氧化法

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采用過碘酸鈉，過碘酸鈉是強氧化劑，能將 HRP 的甘露糖部分 ( 與酶活性無關的部分 ) 的羥基氧化成醛基，然后與抗體的氨基結合 , 形成酶標抗體。

（ 1 ）氧化法操作過程如下：將 5mgHRP 溶于新配制的 1ml 0.30Mol/LpH8.1 重碳酸鈉中，加 0.1 ml 1% 氟二硝基苯 (FDNB) 無水乙醇溶液 , 在室溫中混合后，再加入 1ml 0.04Mol/L~0.08Mol/L 過碘酸鈉 (NaIO4 ) ，置室溫中輕攪 30min ，在溶液呈黃綠色時，加 1ml 0.16Mol/L 乙二醇溶液，在室溫中放置 1h ，使氧化反應中止，然后在 4 ℃ 中對 0.10Mol/L pH 9.5 重碳酸鈉緩沖液透析，換液 3 次。在 3ml HRP －醛基溶液中，加入 5mg( 溶于 1ml 的碳酸鹽緩沖液中 ) ，室溫置 2h~3h ，加入 5mg 氫化硼鈉 (NaBH4 ) ，于 4 ℃ 冰箱放置 3h 或過夜，然后用 PBS 液充分透析，離心去沉淀物。上清液即為酶結合物，純化后使用。

（ 2 ）改良過碘酸鈉法：①取 5mg HRP 溶于 0.5ml 雙餾水中，加入新配制的 0.06Mol/L NaIO4 水溶液 (10ml 雙餾水＋ 128mg NaIO4 ) 0.5ml ，混勻，置 4 ℃ 30min ；② 取出后加入 0.16Mol/L 乙二醇水溶液 (10mlH2 O 0.09ml 乙二醇 )0.5ml ，室溫放置 30min ；③加入含 5mg 純化抗體的水溶液 1ml ，混勻，并裝入透析袋，對 0.05Mol/L pH 9.5 碳酸鹽緩沖液緩緩攪拌透析 6h( 或過夜 ) ，使之結合；④加入 NaBH4 溶液 (5mg/ml)0.2ml ，混勻，置 4 ℃ 2h ；⑤在以上溶液中緩慢加入等體積的飽和硫酸銨溶液，混勻， 4 ℃ 30min ，離心，去上清，沉淀以少許 0.02Mol/L pH7.4 PBS 液溶解，裝入透析袋，以同樣液體在 4 ℃ 透析除鹽過夜；⑥次日取出離心，以除去不溶物，即得酶－抗體 (HRP － IgG) 結合物，以 0.02Mol/L pH 7.4 PBS 液加至 5ml ；⑦效價測定合格后，加入等量優質甘油，分裝小瓶，低溫保存。

戊二醛法與過碘酸鈉法比較

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二馬來酰亞胺法

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二馬來酰亞胺 (Dimaleimide) 能與蛋白質半胱氨酸的硫基反應。首先用 α －巰基乙胺還原蛋白質 (IgG), 并用 N 、 N ‘ －Ｏ－苯二馬來酰亞胺活化，然后除去多余的試劑，最后使含二馬來酰 IgG 與含硫基的 β －半乳糖苷酶連接。具體操作如下：將抗 lgG 抗體溶于 0.1Mol/L pH5.0 醋酸鈉緩沖液并對同一緩沖液透析平衡過夜 , 離心除去不溶性物質 , 抗 IgG(14mg/2ml) 與 10ml α －巰基乙胺在 37 ℃ 溫育 90min 。過 Sephadex 后濃縮使每 ml