基因工程抗體抗體的純化

基因工程抗體抗體的純化 ? ??? 對于表達的抗體需要純化才能準確地進行活性、親和力的鑒定及應用于臨床研究。基因工程抗體的純化方法與通常抗體純化方法基本相同。本文主要介紹利用IMAC方法純化。IMAC的方法原理是利用組氨酸的咪唑基能與二價金屬離子，如Cu2+、Zn2+、Ni2+等發生螯合作用，在表達載體的抗體基因插入位點后面設計5～6個組氨酸，這并不影響抗體正確折疊成活性分子，經過一步洗脫，得到純度較高的抗體。 【材料和試劑】 （1）?? Ni-NTA Resin(QIAGEN)。 （2）?? 大腸桿菌XL1-Blue。 （3）?? 載體pFUW80 （4）?? 超聲緩沖液：50mmol/L磷酸鈉緩沖液pH8.0，含300mmol/L NaCl。 （5）?? 洗脫緩沖液：50mmol/L磷酸鈉緩沖液pH6.0，含300mmol/L NaCl。 【操作步驟】 ?? ?純化可溶性胞質表達抗體(ScFv) ?? （1)將pFS80轉化大腸桿菌XL1-Blue感受態細胞，篩選陽性克隆，接種單菌落于40ml SB培養基(含Amp 100mg/ml；20mmol/L MgCl2 )，37℃培養至OD600 達到0.2，加1mmol/L IPTG，30℃誘導表達過夜。 ?? （2)4000r/min離心10min，收集菌體，用超聲緩沖液重懸菌體，每克菌體用2～5倍體積的超聲緩沖液。20℃放置過夜，次日在冷水中融化；或者用溶菌酶1mg/ml，冰上放置30min。 ?? （3)在冰上超聲破碎菌體，直到核酸釋放度達最大(A260)。若裂解物很粘稠，加RNA酶(10μg/ml)和DNA酶 1(5μg/ml)冰上旋轉10～15min；或者，用注射器反復吹打數次。 ?? （4)1000r/min離心20min，收集上清，加8ml預先用超聲緩沖液平衡的50％SURRY的Ni-NTA Resin柱(直徑1.6cm)，每小時上樣2～3個柱體積，操作在4℃下進行。 ?? （5)用超聲緩沖液洗滌平衡，0.5ml/min，直至A280小于0.01。 ?? （6)用洗脫緩沖液洗柱，直至A280小于0.01。 ?? （7)用洗脫緩沖液pH4.0進行梯度洗脫，紫外檢測收集各洗脫峰，SDS-PAGE電泳鑒定。或用咪唑洗脫緩沖液(50mmol/L磷酸鈉緩沖液含300mmol/L NaCl，0.5mol/L咪唑，pH6.0)進行0～0.5mol/L咪唑梯度洗脫。 ?? ? 純化可溶性表達在周質腔的抗體 ?? （1)誘導表達步驟同上。 ?? （2)菌體用30mmol/L Tris-HCl含20％蔗糖，pH8.0的溶液重懸，每克細菌用80ml。在冰上滴加EDTA至濃度為1mmol/L，并溫和搖動5～10min。 ?? （3)4℃，8000r/min離心20min，棄去上清，用相同體積預冰冷的50mmol/L MgSO4 重懸細菌，冰上搖動10min。 ?? （4)4℃，8000r/min離心20min，收集上清，即為冷的滲透壓休克液。 ?? （5)用超聲緩沖液透析，去除EDTA。 ?? （6)以下步驟同前（4)～（7)。 ??? 亦可根據各種蛋白的不同及純化后的應用，可以添加各種試劑，如0.5～1.0％Tween-20；5～10mmol/L β-巰基乙醇；1mmol/L PMSF；增加NaCl濃度及加入10％甘油。