消化道平滑肌的生理特性及其影響因素
【實驗目的】
1. 觀察消化道平滑肌的收縮性、自動節律性、伸展性等生理特性。
2. 學習胃腸推進性運動實驗方法,并觀察藥物對其影響。
3. 學習離體消化道平滑肌實驗方法,觀察理化因素、藥物對離體消化道平滑肌特性的影響,并分析藥物的作用機制。
【實驗原理】
消化道平滑肌具有肌肉的一般特性,如興奮性和收縮性,同時還有其自身的特殊性,表現為自動節律性、伸展性,并能產生推進性運動,對化學物質、溫度變化、牽張刺激等的影響較敏感,還受神經、體液因素的調節。副交感神經末梢釋放的神經遞質乙酰膽堿及抗膽堿酯酶藥新斯的明等,能增強胃腸運動,而M受體阻斷藥阿托品則抑制胃腸運動;腎上腺素及交感神經末梢釋放的神經遞質去甲腎上腺素可抑制胃腸運動。內臟大神經的多數神經末梢釋放去甲腎上腺素,可通過減慢胃腸基本電節律的頻率和傳播速度,抑制胃腸運動,使胃腸平滑肌收縮減弱。動物實驗中以炭末為標志物,測定單位時間內炭末在胃腸道中前進的距離,可反映胃腸道向前推進的能力和推進速度。
將小腸離體后,置于模擬體內環境的液體環境中,使營養液的離子成分、滲透壓、酸堿度、溫度、氧分壓、營養成分等均類似于體內環境,可在一定時間內保持腸平滑肌的正常活性和功能。藥物可通過與腸平滑肌上受體的相互作用而對離體腸平滑肌產生影響。
【實驗對象】
昆明種小鼠18只,雌雄兼用,體重20~22g,實驗前禁食不禁水8~12h。家兔1只,雌雄不拘,體重2~3kg。
【實驗試劑與器材】
1. 藥品與試劑 1∶20000乙酰膽堿(acetylcholine)、1∶10000新斯的明(neostigmine),1∶200 00阿托品(atropine)、1∶20000腎上腺素(adrenaline)、1∶1000酚妥拉明(phentolamine)、1∶1000普萘洛爾(propranolol)、臺氏液(Tyrode's solution,成分:NaCl 8.0g,KCl 0.2g,CaCl2 0.2g,NaHCO3 1.0g,NaH2PO4 0.05g,MgCl2 0.1g,葡萄糖 1.0g,加蒸餾水至1000mL)、無鈣臺氏液(臺氏液中去除CaCl2和MgCl2)、0.9%氯化鈉注射液、5%炭末阿拉伯膠(10%阿拉伯膠為溶劑)、苦味酸溶液等。
2. 器材 生物信號記錄分析系統、恒溫平滑肌浴管、增氧泵、肌張力換能器(量程為25g以下)、萬能支架、雙凹夾、燒杯、注射器、電子天平、手術剪、眼科剪、眼科鑷、直尺、玻璃板、1mL注射器、紗布等。
【實驗方法與步驟】
1. 動物分組與給藥 取昆明種小鼠18只,稱重,標號后,隨機分成對照組、新斯的明組、腎上腺素組,每組6只,雌雄各半。對照組皮下注射0.9%氯化鈉注射液0.2mL/10g,新斯的明組皮下注射1:10000新斯的明0.2mL/10g,腎上腺素組皮下注射1:20000腎上腺素0.2mL/10g。
2. 胃腸推進率的測定與計算 給藥20min后,給每只小鼠灌胃5%炭末阿拉伯膠混懸液0.2mL,立即開始計時,灌胃炭末后15min時將小鼠頸椎脫臼處死,剖開腹部,取出整個胃腸道,置于盛有少量生理鹽水的培養皿中,用眼科剪剪去附著在腸管上的腸系膜,將腸管不加牽拉地輕輕平鋪在玻璃板上(玻璃板上滴有少許生理鹽水,以防腸管粘在玻璃板上)。以胃的幽門為起點,回盲部為終點,測量小腸全長(cm),并測量自幽門開始,炭末在腸管內移行的距離(cm),計算每只小鼠炭末移動距離占小腸全長的百分率為胃腸推進率。
3. 數據統計與分析 將實驗結果輸入SPSS統計軟件中,以單因素方差分析(ANOVA)比較各組間是否存在差異性。將結果記入表31-2中。
4. 離體腸平滑肌實驗準備
(1)啟動恒溫平滑肌實驗系統 恒溫浴鍋中加蒸餾水,平滑肌浴管中加入臺氏液至浴管高度的2/3處(約50mL)。開啟電源,設定工作溫度為38℃,使浴管內溫度升高并穩定在38℃左右。
(2)制備標本 提起家兔后肢使其倒懸,用槌猛擊兔的頭枕部使其昏迷,剖腹,自胃與十二指腸交界處始,將腸系膜沿腸緣剪開,分離出長約20~30cm的腸管(空腸),立即置于4℃左右的臺氏液中,剪成數段,每段長2~3cm。如腸腔內容物較多,可用注射器吸取臺氏液輕輕沖洗腸腔1~2次,基本干凈后,置4℃臺氏液中備用。
5. 建立離體腸平滑肌實驗系統
(1)開啟生物信號記錄分析系統,設定實驗信號輸入為張力,將張力換能器調零。
(2)取一段長2~3cm的腸段,一端固定于浴管底部的小鉤上,另一端用線連接于肌張力換能器的應變簧片上。將標本浸于含38℃臺氏液的浴管中。
(3)調整腸管及換能器的高度,使腸管具有一定的前負荷,一般前負荷為1~4g。腸段牽拉過緊、過松,或與周圍管壁接觸、摩擦,都將影響實驗結果。
(4)用增氧泵向浴管中供氧,同時可起攪拌作用。
(5)待腸段活動穩定一段時間后,開始實驗觀察。
6. 藥物及理化因素對離體腸平滑肌運動特性的影響
觀察生理條件下(臺氏液,38℃)腸平滑肌的生理特性,如收縮性、伸展性、自動節律性,并記錄其收縮頻率、收縮幅度、張力等。然后穩定溫度在38℃,觀察下列藥物和理化因素對腸段活動的影響。
(1)向浴管內臺氏液中加入1:20000的乙酰膽堿0.2mL,觀察、描記腸段活動情況的變化。觀察到明顯效果后,沖洗腸段,重復更換1~2次臺氏液,穩定一段時間,使腸段活動基本恢復正常,進行下一項目觀察。
(2)向浴管內臺氏液中加入1:20000阿托品0.2mL,1min后,再加入1:20000的乙酰膽堿0.2mL,觀察腸段活動變化,比較與上一項結果有何不同。同上法沖洗腸段。
(3)向浴管內臺氏液中加入1:10000的新斯的明0.2mL,觀察腸段活動有何變化。待出現明顯作用后,沖洗。
(4)向浴管內臺氏液中加入1:20000阿托品0.2mL,1min后,再加入1:10000的新斯的明0.2mL,觀察腸段活動變化,并與上一項結果比較。沖洗。
(5)向浴管內臺氏液中加入1:20000的腎上腺素0.2mL,描記腸段活動變化情況。待作用明顯后,沖洗。
(6)向浴管內臺氏液中加入1:1000的普萘洛爾0.2mL,1min后,再加入1:20000的腎上腺素0.2mL,觀察腸段活動情況,與上一項結果比較。沖洗。
(7)向浴管內臺氏液中加入1:1000的酚妥拉明和1:20000的腎上腺素各0.2mL,觀察腸段運動變化,并與第6項結果比較。沖洗。
(8)向浴管內臺氏液中加入1:1000的普萘洛爾0.2mL,1min后,再加入1:1000的酚妥拉明0.2mL和1:20000的腎上腺素0.2mL,觀察描記腸段運動變化情況,并與(6),(7),(8)項結果比較。沖洗。
(9)放掉臺氏液,將腸段用38℃無Ca2+臺氏液沖洗2次,換新鮮38℃的無Ca2+臺氏液,觀察小腸收縮曲線有何變化。
(10)向無Ca2+臺氏液浴管內加入1:20000的乙酰膽堿0.2mL,觀察腸段活動變化。
(11)用38℃正常(含Ca2+)臺氏液沖洗腸段3次,加正常臺氏液于平滑肌浴管中,觀察腸平滑肌自發性收縮是否恢復。
(12)向含Ca2+臺氏液浴管內加入1:20000的乙酰膽堿0.2mL,觀察腸段對乙酰膽堿的反應。沖洗。
以上觀察項目均在38℃恒溫條件下進行。
(13)將浴管內38℃臺氏液放掉,并關閉恒溫器電源,向浴管內加入室溫臺氏液,觀察在室溫臺氏液中的腸段平滑肌收縮情況,描記收縮曲線。
(14)啟動恒溫加熱系統,使浴管內臺氏液溫度升至38℃,觀察收縮曲線是否恢復。
實驗結束后,整理實驗結果,將結果記入表31-3,分析藥物及Ca2+、溫度對腸平滑肌的作用及其機制。
7. 將上述離體兔腸平滑肌標本去除黏膜后,用玻璃微電極(電極內液為3mol/L的KCl)刺入平滑肌細胞內,通過微電極放大器將平滑肌細胞內電位變化輸入生物信號記錄系統,可同步記錄腸平滑肌細胞內電位變化及肌張力變化情況。
【注意事項】
1. 觀察小鼠胃腸推進率實驗中,灌入胃炭末后要準確計時,并及時處死小鼠。
2. 測量小腸長度和炭末移動距離時,注意勿過度牽拉腸管。
3. 離體實驗中的加藥量為參考劑量,效果不明顯時,可予以增補,但應避免一次加藥量過多。
4. 每個實驗項目觀察到明顯效果后,即沖洗腸段,更換臺氏液,待腸段活動穩定后,觀察下一項目。
5. 換液時加入的臺氏液量應保持一致,避免因藥物濃度變化,影響實驗結果的可比性。
6. 注意對浴管中腸段標本供氧。
7. 加藥液的注射器不能混用。給藥時要將藥直接加在液面上方,切勿滴到管壁上或將針頭伸到液面下。
思 考 題
1. 腸平滑肌上存在哪些受體?其激動后對腸平滑肌的運動產生何種影響?
2. 乙酰膽堿對腸平滑肌活動有何影響?阿托品對乙酰膽堿所致的離體小腸平滑肌收縮變化有何影響?機制何在?新斯的明對腸平滑肌的作用如何?與乙酰膽堿比較有何差異?
3. 腎上腺素對腸平滑肌活動有何影響?普萘洛爾和酚妥拉明對腎上腺素所致的離體小腸平滑肌收縮變化有何影響?為什么?
4. Ca2+、溫度對離體小腸平滑肌活動有何影響?原因如何?
(張軒萍)
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