【實驗目的】

１． 學習幽門螺桿菌小鼠模型的建立方法。

２． 掌握細菌染色——Warthin-Starry硝酸銀染色方法。

３． 了解熒光定量PCR檢測原理。

【實驗原理】

胃細菌學的研究，長期以來是一個被忽視的領域。1983年Marshall和Warren從慢性活動性胃炎患者胃黏膜活檢標本中分離到幽門螺桿菌（Helicobacter pylori, Hp），是對這一領域重要的突破，它的發現對消化病學、特別是胃十二指腸病學的發展起了極大的推動作用。現在已經清楚幽門螺桿菌是許多慢性胃病（慢性胃炎、消化性潰瘍、胃癌等）發生發展中一個重要致病因子，已被WHO列入第一級致癌物質。因此，準確檢測Hp對防治胃炎、消化性潰瘍有重要意義。本實驗在建立幽門螺桿菌小鼠模型的基礎上，采用快速尿素酶測定(RUT) 試驗、Warthin-Starry硝酸銀染色和熒光定量PCR法3種手段檢測小鼠感染幽門螺桿菌的情況。

【實驗對象】

昆明小鼠40只（雄性，3周齡，體重16～18 g）。動物飼養控制條件為清潔級。

【實驗試劑與器材】

1. 器材　熒光定量PCR儀，微需氧袋。

2. 試劑　幽門螺桿菌菌株NCTC 11637，布氏肉湯培養基（Brucella Broth），2％尿素水溶液，酚紅磷酸緩沖液。幽門螺桿菌熒光定量PCR試劑盒。

醋酸緩沖液(pH3.6)：

無水醋酸鈉????????? 1.64 g

醋酸??????????????? 2.5 ml

蒸餾水????????????? 200 ml

1%硝酸銀溶液：

硝酸銀????????????? 0.5 g

醋酸緩沖液????????? 50 ml

2%對苯二酚溶液：

1，4-對苯二酚?????? 200 mg

醋酸緩沖液????????? 10 ml

2%明膠溶液：

明膠??????????????? 1 g

醋酸緩沖液????????? 50 ml

加溫溶解

顯色液：

2%明膠溶液????????? 20 ml

2%對苯二酚溶液????? 3.5 ml

1%硝酸銀溶液??????? 1.5 ml

顯色前混合

【實驗方法與步驟】

1. Hp的培養　把幽門螺桿菌NCTC 11637接種到布氏肉湯培養基上，迅速放入微需氧袋，35℃，培養72 h。

2. 分組與處理　采用分組設計，應用隨機數字表將40只小鼠分成實驗組和對照組(各20只)。

3. 幽門螺桿菌小鼠模型的建立　實驗組每只小鼠灌喂Hp菌液200μl(含菌5×108 CFU)間隔2 d，共感染3次。所有動物灌喂處理前禁食24 h，禁飲水4 h，灌喂后繼續禁食、水4 h。對照組灌喂等量布氏肉湯培養基。

4. 解剖　距末次灌喂菌液8周后，脫臼處死，剖腹采集食道、胃、小腸、結腸和直腸組織，進行下述檢測。

【觀察項目】

1. 快速尿素酶測定(RUT) 試驗

無菌2％尿素水溶液，酚紅磷酸緩沖液各3滴滴于標本上，37℃溫育30 min，變紅色者為陽性。

2. 病理組織學檢查

組織塊用4％甲醛固定，制作石蠟切片作Warthin-Starry硝酸銀染色。

Warthin-Starry硝酸銀染色法操作步驟：

①切片脫蠟至水。

②醋酸鹽緩沖液沖洗切片2次，1min/次。

③加入1%硝酸銀水溶液（預熱達60℃）處理切片60 min，在烤箱中進行。

④于顯影液中（60℃烤箱）3 min，鏡下控制，如果沒達到要求，還可繼續延長時間，直到合適為止。

⑤ 取出切片，用60℃熱水洗切片。

⑥醋酸鹽緩沖液沖洗切片2次，1min/次。

⑦脫水，透明，封片。

3. 熒光定量PCR法檢測

選用幽門螺桿菌NCTC 11637特異性的引物和探針進行擴增雜交，操作按試劑盒說明書進行；采用空腸彎曲菌、解尿支原體作為對照菌進行熒光定量PCR。

【注意事項】

1. 配制和使用硝酸銀溶液時要格外小心，不要滴灑在地上，桌上及手上等處，氧化為黑色的液點極難去除。

2. 熒光定量PCR操作時要戴口罩及一次性手套，并盡可能在低溫下操作。

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　思 考 題

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簡述熒光定量PCR的基本原理。

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（曲　萍）