二維凝膠電泳質譜技術等電聚焦電泳
二維凝膠電泳質譜技術等電聚焦電泳 ? ??? 1. IPG的pH值范圍 ??? 等電聚焦電泳 (isoelectrofocusing,IEF)目前廣泛使用商品化的IPG膠條。其pH值范圍的選擇一般遵循以下原則:①pH 3一10線性梯度膠適于了解樣本中所有蛋白質的分布情況;②pH 3―10非線性梯度膠能提高pH 5―7之間的樣本蛋白質解析度;③聯合使用pH 4~7和pH 6~11梯度膠可獲得相關pH范圍的更清晰的蛋白質分布情況;④小pH范圍梯度膠(如pH 3.5―4.5,pH 4.5―5.5,pH 5―6等)可提供高分辨率的蛋白質分布圖譜。 ? ??? 2.IPG系統主要的蛋白質上樣方式 ??? (1)泡漲上樣:可以允許低濃度樣品上樣,有較大的上樣量。但因需要泡漲過夜,故蛋白質可能發生溶解或修飾。 ??? (2)杯上樣:容易在上樣處形成蛋白質沉淀,蛋白質樣品易滲漏。但對于pH 6~1l和pH 6~9的堿性膠條可以得到更好的分離效果。 上樣重泡漲液一般為相應的提取液+相應的兩性電解質(o.5%)+痕量溴酚藍。 ? ??? 3.膠條水化時間和等電聚焦電泳時間 ??? (1)膠條水化時間:一般為12~14h。 ??? (2)等電聚焦電泳時間:根據膠條的長度及pH梯度范圍來確定,經常需要根據經驗和實踐決定。一般采用逐漸增加電壓的方式,?cm膠條需完成8 000Vh到32 000Vh,llcm膠條20 000Vh到48 000Vh,17cm膠條50 000Vh到80 000Vh。等電聚焦電泳時達到設定的伏特小時數所需時間,受樣品和緩沖液的影響,也受IPG膠條的pH值范圍的影響。如果是更復雜的樣品,或者蛋白質數量增多,都需要增加聚焦的伏特小時數。
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