蛋白質組學研究雙相凝膠電泳分離技術

蛋白質組學研究雙相凝膠電泳分離技術 ? ??? 蛋白質 組學研究主要依賴于大規模高通量分離和分析技術的進步，目前最成熟、最有效的技術仍然是雙相凝膠電泳分離―生物質譜鑒定技術，即首先用雙相凝膠電泳分離純化蛋白質，結合計算機軟件分析得到電泳圖譜，再進一步用生物質譜技術對分離出的蛋白質進行鑒定，并運用現代生物信息學的技術對所得到的數據進行處理，對蛋白質及其執行的生命活動做出盡可能精細、準確及本質的闡述。下面簡要介紹目前蛋白質組學主要技術的發展。 ? ??? 雙相凝膠電泳技術是蛋白質組研究中最早的支撐技術之一。雙相凝膠電泳的雙相指第一相為等電聚焦電泳(IEF，等電點信息)，第二相為SDS凝膠電泳(SDS―PAGE，相對分子質量信息)。早期雙相電泳中第一相用載體兩性電解質產生pH梯度。固相pH梯度(1PG)等電聚焦技術大大改善了雙相電泳的分辨率、重復性和上樣量。根據所采用的膠條的大小和pH梯度的不同，二維凝膠電泳可以同時分離5 000個蛋白質點，能檢測<1ng的蛋白質點，同時它能提供一個完整的蛋白質表達圖譜，從而可以反應蛋白質表達量的變化，以及異構體(isoform)或翻譯后修飾的情況。而液相色譜質譜聯用方法(LC―MS／MS)鑒定的是肽段，因此等電點和相對分子質量的信息丟失了，而且需要用同位素標記進行定量比較。 ? ??? 由于雙相凝膠電泳對批量蛋白質可實現一次分離，具有高分辨率，便于計算機進行圖像分析處理，可以很好地與質譜分析等鑒定方法匹配，以及能夠研究蛋白的翻譯后修飾(如磷酸化，糖基化等)等優點，因而成為目前分離蛋白質組分的核心技術。但是雙相凝膠電泳技術仍然存在許多不足，對于疏水性蛋白質、極酸或極堿蛋白質、高相對分子質量蛋白質以及極微量蛋白質的分辨率仍感困難。目前對雙相凝膠電泳技術的改進主要集中在疏水性蛋白質樣品的制備、分離能力的改善，以及染色方法等方面。 ? ??? 雙相電泳成功的關鍵在于建立一套有效的、可重復的樣品制備方法。由于樣品種類的差異和實驗需求的不同，沒有一種樣品提取方法能適用于各種樣品，絕大多數樣品都需要通過多次實驗才能摸索到最適宜的雙相電泳條件。目前對疏水性蛋白質樣品的制備，常選用含有多種離液劑、去垢劑和還原劑的復雜混合溶液，Bio―Rad和Amersham Pharmacia公司都有相應產品，可以獲得相對理想的提取。 ? ??? 窄IPG技術的發展提高了電泳的分辨率，把IPG膠條的pH梯度范圍縮小至1～1．5pH，通過多個連續pH范圍的窄IPG代替單個寬范圍的lPG。同時用增加分離距離的方法提高雙相電泳的分辨力，24cm的窄lPG膠條可以得到非常高的分辨力。 ? ??? 雙相電泳的考馬斯亮藍染色靈敏度較低，銀染雖然靈敏度高但重復性較差。熒光染色是較新的染色方法，靈敏度與銀染相似，但速度快且結果可靠。用兩種不同顏色的熒光染料分別標記兩個樣品，然后混合電泳及結果分析，可以明顯提高雙相電泳的重復性。