植物組織中可溶性糖含量測定(苯酚法)
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植物 體內的碳素營養狀況以及農產品的品質性狀,常以糖含量作為重要指標;植物為了適應逆境條件,如干旱、低溫,也會主動積累一些可溶性糖,降低滲透勢和冰點,以適應外界環境條件的變化。 一、原理 苯酚法測定可溶性糖原理:植物體內的可溶性糖主要是指能溶于水及乙醇的單糖和寡聚糖。苯酚法測定可溶性糖的原理是:糖在濃硫酸作用下,脫水生成的糠醛或羥甲基糠醛(分子式見蒽酮法)能與苯酚縮合成一種橙紅色化合物,在10~100mg范圍內其顏色深淺與糖的含量成正比,且在485nm波長下有最大吸收峰,故可用比色法在此波長下測定。苯酚法可用于甲基化的糖、戊糖和多聚糖的測定,方法簡單,試劑便宜,靈敏度高,實驗時基本不受蛋白質 存在的影響,并且產生的顏色可穩定160min以上。 二、材料、儀器 設備及試劑 (一)材料:新鮮的植物葉片。 (二)儀器設備:1. 分光光度計;2. 水浴鍋;3. 刻度試管;4. 刻度吸管。 (三)試劑:1. 90%苯酚溶液 稱取90克苯酚(AR),加蒸餾水10ml溶解,在室溫下可保存數月;2. 9%苯酚溶液 取3ml90%苯酚溶液,加蒸餾水至30ml,現配現用;3. 濃硫酸(比重1.84);4. 1%蔗糖標準液 將分析純蔗糖在80℃下烘至恒重,精確稱取1.000克。加少量水溶解,轉入100ml容量瓶中,加入0.5ml濃硫酸,用蒸餾水定容至刻度;5. 100μg/L 蔗糖標準液 精確吸取1%蔗糖標準液1ml加入100ml容量瓶中,加水至刻度。 三、實驗步驟 1. 標準曲線的制:向試管內加入1ml9%苯酚溶液,搖勻,再從管液正面以5~20S加入5ml濃硫酸,搖勻。比色液總體積為8ml,在室溫下放置30min,比色。然后以空白為參比,在485nm波長下比色,以糖含量為橫坐標,吸光度為縱坐標,繪制標準曲線,求出標準直線方程。 2. 可溶性糖的提取取:取新鮮植物葉片,擦凈表面污物,剪碎混勻,稱取0.10~0.30g,共3份(或干材料),分別放入3支刻度試管中,加入5~10ml蒸餾水,塑料薄膜封口,于沸水中提取30min(提取2次),提取液過濾入25ml容量瓶中,反復漂洗試管及殘渣,定容至刻度。 3. 測定 吸取0.5ml樣品液于試管中(重復2次),加蒸餾水1.5ml,同制作標準曲線的步驟,按順序分別加入苯酚、濃硫酸溶液,顯色并測定吸光度。由標準曲線查出糖的量。 四、結果計算 按下式計算測試樣品的糖含量: 可溶性糖含量(%)=從標準曲線查得糖的量(μg)×提取液體積(ml)×稀釋倍數/