植物不育性的觀察與鑒定技術

相關專題 ? 雄性不育是指在兩性花植物 中雄蕊敗育的現象。有些雄性不育現象是可以遺傳的，采用一定的方法可育成穩定遺傳的雄性不育系。雄性不育系在雜交過程中有著重要的作用，我們都知道，雜種優勢普遍存在，但很多植物由于單花結籽量少，獲得雜交種子很難，從而使雜交種子生產成本太高而難以在生產中應用，利用雄性不育系配制雜交種是簡化制種的有效手段，可以降低雜交種子生產成本，提高雜種率，擴大雜種優勢的利用范圍。 雄性不育的遺傳類型可以分成下列三種：細胞質雄性不育類型，細胞核雄性不育類型和核質互作雄性不育類型。 無論植物的不育性是那種類型，它們都會在一定的組織中表現出來，有些時候不育株還會影響到內源激素的變化等。十字花科、傘形科、百合科、茄科等蔬菜作物中，普遍存在不同程度的雄性不育現象。由于遺傳 機制、植株營養狀況、溫度高低及病毒侵染與否等的不同，雄蕊退化大概可分成一下幾種類型： （一）花藥退化型：一般表現為花冠較小，雄蕊的花藥退化成線狀或花瓣狀，顏色淺而無花粉； （二）花粉不育型：這一類花冠、花藥接近正常，往往呈現亮藥現象或褐藥現象，藥中無花粉或有少量無效花粉、鏡檢時，有時會發現少量 干癟、畸形以及特大花粉粒等，大多數是無生活力的花藥； （三）花藥不開裂型：這類不育型雖然能形成正常花粉，但由于花藥 不開裂不能正常散粉，花粉往往由于過熟而死亡； （四）長柱型功能不育：這一類型花柱特長，往往花蕾期柱頭外露，雖然能夠形成正常花粉但散落不到柱頭上去； （五）嵌合型不育：在同一植株上有的花序或花是可育的，而有的花序或花則是不育的，在一朵花中有可育花藥，也有不育花藥。 上述五種雄性不育型中以（一）、（二）兩種類型為佳 ，利用較為方便，穩定可靠。除了上述五種雄性不育型外，還有其它類型，如環境敏感型雄性不育。根據上述不同雄性不育類型的識別、鑒定和選擇雄性不育株，是對雄性不育材料的鑒定和選擇的主要方法。但是，對敗粉不育型通常不能用肉眼直接進行鑒定，需要用顯微鏡 鏡檢，通常把過大、過小或畸形花粉作為無生活力花粉計算，統計不育率。這種鏡檢方法只能作為相對的直觀判斷，要作出準確的判斷還得進行人工授粉直接測定。隨著科學技術的發展，分子生物學的運用越來越廣泛，植物不育性的觀察和鑒定，也可借助分子生物學的手段進行，從而可以從基因水平上了解不育性的機理。實驗目的是學習識別、鑒定雄性不育株的方法，并了解不同植物不育性的表現類型；通過本實驗操作，學會利用不同的實驗方法來鑒定植物的不育性；自行設計測交篩選保持系的方法。 下面就以蘿卜為例來說明觀察和鑒定其不育株的幾種方法。 一、試材及用具： 1．試材：供觀察和鑒定用的材料包括大白菜、甘藍、蘿卜、辣椒等雄性不育材料的開花種株。 2．用具：顯微鏡、鑷子、凹載玻片、指形管、培養皿、離心機、電泳槽等。醋酸洋紅、正丙酸洋紅等試劑，緩沖液、飽和酚、凝膠以及電泳緩沖液、0.7%瓊脂糖、溴化乙啶、氯仿、冰乙醇等。 二、方法步驟 （一）細胞形態學觀察 在開花期取植株主莖頂端整個總狀花序，按發育時期選取不同蕾長（分別為1～2、3、4、5、6和7～8mm）的花蕾，剝出花藥，經鏡檢確定小孢子發生的5個時期：四分體時期、單核早期、單核晚期、二胞花粉期和三核花粉期。 光學顯微鏡觀察：花藥用納瓦興液固定，流水沖洗，梯度酒精脫水至70%酒精時，轉入稀釋的艾氏蘇木精中整體染色，再經梯度酒精脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，連續切片，其切片厚度為5～7um。Olympus BH2型顯微鏡觀察并拍照。 掃描電鏡觀察：從花瓣即將張開的花蕾中取出花藥并立即放入2.5%戊二醛（0.05mol/L pH 7.2）中固定，磷酸緩沖液沖洗后換入1%高錳酸鉀溶液內再固定30min；雙蒸水沖洗，梯度酒精脫水；臨界點干燥后剝開藥室，LB－3型噴鍍儀噴薄層黃金，S－520型掃描電鏡觀察，拍照記錄。 蘿卜雄性不育系花藥和小孢子發生的細胞形態學觀察： 1．小孢子敗育 不育系中小孢子母細胞減數分裂時的某些不同步現象與其保持系基本相同。由四分體初釋出的早期單核小孢子與保持系也無可見差異。但當單核小孢子的細胞質內出現小液泡時，這些小孢子即呈現敗育現象：如細胞質淺染，外粉壁停止發育而顯得較薄，整個小孢子小于保持系相應時期的小孢子。單核晚期的小孢子敗育更趨明顯：細胞質稀薄并收縮；細胞核染色也變淡，甚至在有的細胞核內只見到深染的核仁；小孢子形狀不規則且大小不等。以后，小孢子的內含物愈益減少，小孢子彼此粘連，在進入雄配子體發育之前就已逐漸解體成為空殼或僅留下少量殘余物，并被高度液泡化的膨大絨氈層細胞擠到藥室腔中央，最后與解體的絨氈層細胞粘成團塊，終至消失，開花期的花藥內均未見花粉粒。 2．絨氈層異常 花藥發育中藥室的絨氈層細胞異常是十分普遍的現象。其細胞質內早在四分體時期即有液泡出現，胞質淡染；進入單核小孢子時期，絨氈層細胞內液泡化更加明顯，整個細胞迅速膨大且凸向藥室腔，細胞徑向壁漸模糊。相當于單核小孢子晚期時，絨氈層細胞中的液泡繼續擴大，細胞也異常肥大，常在原位彼此粘接，把敗育小孢子群圍在藥室中央。以后，這種畸形的絨氈層和敗育小孢子消失，或在藥室內殘留極少量的解體物。這時的花藥壁也都皺縮。 （二）外部形態鑒定（花器形態以及花粉生活力觀察） 在田間觀察、鑒定指定作物的雄性不育株，觀察記載不同不育類型，并將其不育類型加以區分。將花藥可能有花粉的不育株的花，采集起來裝入指形管，在管外標簽上注明株號、雄性不育類型，帶回室內。把不同類型雄性不育花的花藥用鑷子取下來，放到凹載玻片的凹處或平載玻片中央，滴上一滴醋酸洋紅或正丙酸洋紅，用鑷子尖把花藥搗碎，除去藥殼及花絲等，然后放到顯微鏡下鏡檢，觀察花粉形態、大小以及著色深淺等。一般瘦小干癟、過大或畸形的花粉為無生活力或生活力弱的花粉，著色深者為生活力較強，不著色者為無生活力，著色淺為生活力較弱的花粉。但是特大花粉往往著色較深，但不能正常發芽，也歸于無生活力花粉之內。 （三）分子鑒定法（葉綠體DNA的限定性內切酶分析） 1．配制緩沖液A、B、C、TE溶液、飽和酚、凝膠以及電泳緩沖液、0.7％瓊脂糖、溴化乙啶，采用李繼耕所用方法。 2．樣品提取，300g葉片，加3倍體積緩沖液A勻漿、過濾、1500×g4℃下離心10分鐘，葉綠體沉淀用緩沖液A洗兩次，最后懸浮于20ml緩沖液A中，加MgCl2至0.01mol·L-1，DNA酶50ug/mL，4℃保溫1h、加150mL緩沖液B，1500×g4℃下離心15min，反復洗3次，最后把葉綠體懸浮于緩沖液C中，加蛋白酶，加等體積酚，加等體積氯仿，12000×g4℃下離心15min，提取水相，反復提取2次。加兩倍體積的冷乙醇于－20℃冰箱中過夜。1500×g4℃下離心10min，再加70％冷乙醇洗2次，經低溫真空冷凍干燥，溶于TE緩沖液中于4℃下保存備用。 3．限制性核酸內切酶消化，EcoRI、BamHI。 4．電泳，用0.7%瓊脂糖凝膠作單向垂直板電泳，穩壓30V，15～20h，在0.5ug·g-1溴化乙啶中染色30min，在60nm紫外燈下觀察并拍照。標準蛋白為Phamacia公司產品。EcoRI、BamHI為中科院生物物理所生化試劑廠產品。 葉綠體DNA用EcoRI消化后的電泳圖式：用EcoRI消化蘿卜雄性不育系401A與401B（保持系）的ctDNA內切酶切割的片段，從單向Agarose凝膠電泳分離的ctDNA限制性片斷可以看出，用EcoRI消化ctDNA，不育系可以分離出分子量不同的13個片斷，保持系可以分離出分子量不同的15個片斷。不育系與保持系的ctDNA相比較，不育系缺E2和E4片斷，而且保持系的E5、E7、E16片斷比不育系藥寬，從ctDNA的單向AGE圖式上，只能分辨出分子量不同的片斷，不能說明DNA的順序和堿基排列的差異。把環狀ctDNA分子從特異位點切開，分割成分子量不同的一些片斷，從這些片斷之間的差異，也可反應不育系與可育系的ctDNA基因結構的某些差異。