PCR擴增免疫球蛋白重鏈的CDR3基因

PCR 擴增免疫球蛋白重鏈的CDR3基因 ? ??? 在B細胞發育過程中,V―D―J的重排可導致某些核苷酸的隨機缺失或插入。因此,不同的B細胞克隆經PCR后產生的擴增片段長短不一。正常的多克隆淋巴細胞群的擴增片段含有不同長度的片段,電泳檢查時呈現出所謂的“片狀”結構,而單克隆的B淋巴細胞白血病標本經PCR擴增后,產生一明顯的同一長度的擴增片段,電泳時呈現出緊密折帶狀結構。這就是應用PCR快速檢測單克隆性的殘留白血病細胞的原理。白血病細胞標本經擴增后產生110bp上下的帶,而正常的多克隆細胞則呈現為片狀結構。 ? ??? 免疫球蛋白基因的重排具有多樣性,表現為PCR擴增后產物在電泳位置上的改變,同一白血病細胞克隆的擴增產物在電泳的位置上相同。因此,可以單一的應用PCR擴增,經6％聚丙烯酰胺凝膠電泳分離,溴化乙錠染色后進行觀察,對殘留白血病細胞克隆進行檢測,也可以達到相當高的檢測敏感性(1/104 ),如應用放射性同位素標記的寡核苷酸探針雜交分析,可以達到更高的敏感性。 ? ??? 利用引物5’末端提供的限制性內切酶位點,可以將擴增產物進行序列分析。從中選擇出獨特的結構,體外合成某一白血病細胞克隆所特異的寡核苷酸探針,可在個體的水平上檢測殘留的白血病細胞,并可進行定量分析,有助于更精確的探討臨床治療問題。 ? 【操作方法】 （1） 引物設計：引物1來源于FR3中的一段最保守的序列,在所有的VH家族都有同源性。該引物5’端經修飾而產生一個限制性內切酶SaLI的位點,引物序列如下:5’―CTGTCGACACGGCCGTGTATTACTG―3’，引物2的序列是與JH片段3’端相互補的反義序列,為6個JH片段中最保守的一段序列。其5’末端經點突變產生限制性內切酶Rst的酶切位點。序列如下:5’―AACTGCAGAGGAGACGGTGACC―3’寡核苷酸探針的序列為引物2的3’端上游的一段序列,因此可用于檢測PCR擴增的產物,探針序列如下:5’―GTGACCAGGGTNCCTTGGCCCCAG―3’。 （2） DNA提取：參考第三節； （3） PCR：①配制下列混合液:DNA(1μg)3μl，10×PCR緩沖液10μl，4×dNTP (2.5mol/L)8μl，引物I、2 各1 OD/100μl 2μl，DMSO 5μl，雙蒸水68μl；②預變性95℃10min；③加入Taq DNA聚合酶3U(1.5U/μl)；④加入100μl礦物油后, 93℃×1min,55℃×1min,72℃×2min,共30個循環；最后一個循環72℃×10min。 （4）聚丙烯酰胺凝膠電泳、Southern印跡及其結果分析。