RNA酶保護試驗((RNase?Protection?Assay,RPA)方法

一、試劑準備 1． GACU POOL：取100mM ATP、CTP、GTP各2.78μl、100mM UTP 0.06μl，加DEPC H2O至100μl。 2. 雜交緩沖液 IPES 0.134g、0.5M EDTA（pH8.0）20μl、5M NaCl 0.8ml、甲酰胺8ml，加DEPC H2O至10ml。 3. RNase消化液：5M NaCl 120μl、1M Tris-HCl(pH7.4) 20μl、0.5M EDTA（pH8.0）20μl、RNase A(10mg/ml) 8μl、RNase T1(250U/μl) 1μl，加DEPC H2O至2ml 二、操作步驟 1．反義RNA可由含T7或SP6啟動子的重組質粒為模板制備，也可以用含啟動子的PCR產物為模板制備，本文介紹后者。 （1）設計含T7啟動子的PCR引物 由于PCR產物將作為合成反義RNA的模板，所以一對引物中的下游引物5’-端要含T7啟動子序列: T7啟動子序列為：5’-TAATACGACTCACTATAGGG 　 引物設計的其他要求與一般PCR引物的設計相同。PCR產物的長度決定了反義RNA探針的長度，具體設計時可考慮100-400bp長。最好采用巢式PCR，即先擴增出一較長的片段，再以該片段為模板擴增出較短的片段，以保證探針的特異性，如下圖所示： 上游引物 下游引物Ⅱ T7 啟動子序列 下游引物Ⅰ （2）PCR 先用上游引物和下游引物Ⅰ進行PCR，再以PCR 產物為模板,用上游引物和下游引物Ⅱ-T7進行二次PCR(具體操作參見PCR章節)。 （3）探針合成標記與純化 在0.5ml 離心管中加入下列試劑： RNasin （40U/μl） 0.5μl GACU POOL GAC （含GTP、CTP、ATP各2.75 mM,UTP 61μM） 2μl [α-32P]UTP(10μCi/μl) 2.5μl DTT (二硫蘇糖醇，0.1M) 1μl 5×轉錄 buffer 2μl 模板（50ng/μl） 1μl T7 RNA 聚合酶 (15U) 1μl 混合后，短暫離心，37OC保溫1hr。 加入DNaseⅠ（10U/μl）1μl, 37OC 15min, 然后75 OC 10min以滅活DNAseⅠ和T7 RNA 聚合酶。 加入：飽和酚 50μl 氯仿 50μl 酵母tRNA（2μg/μl） 4μl DEPC H2O 100μl 室溫下充分混勻，離心10000g×2min。取上層液置另一0.5 ml離心管中，加入100μl氯仿，混勻，離心10000g×2min。將上層液轉移至另一0.5ml 離心管中，再加入3M NaAc 10μl、預冷無水乙醇250μl，混勻后，-20OC靜置30min。4OC離心13500g×10min。棄上清液，沉淀用75%乙醇100μl洗滌，4OC離心13500g×2min, 棄上清液。室溫下揮發殘留乙醇。加入50μl雜交緩沖液溶解沉淀，4OC下保存待用。可用尿素-聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測探針質量。（參見本節電泳步驟）。 2．雜交 （1） RNA提取后溶解在雜交緩沖液中，濃度為1μg/μl。 （2）取8μl RNA加入1-3μl探針（根據探針檢測結果調整）于0.5ml 離心管中。 （2） 80OC保溫2min，然后40-45OC下雜交12-18hr。 3. 消化 (1) 雜交管于37 OC保溫15min，加入RNase消化液，37 OC保溫30min。 (2) 加入10%SDS 10μl、10μg/μl蛋白酶K 20μl，混勻，37 OC保溫10min。 (3) 加入65μl飽和酚和65μl氯仿，混勻，室溫離心，10000g×2min。 (4) 轉移上層液到另一0.5離心管中，加入10μl酵母tRNA和3M NaAc 15μl，再加入200μl異丙醇，混勻后，置-20OC 30min，4 OC離心,135000g×10min。 (5) 棄上清液，室溫下揮發乙醇，加入5-8μl上樣緩沖液溶解沉淀。 4、電泳與放射自顯影 （1）配制凝膠：(50ml) 40%丙烯酰胺-亞甲雙丙烯酰胺（19：1） 6.25ml 5×TBE 10ml 尿素 24g 加H2O至50ml 溶解后加入25%過硫酸胺50μl，TEMED 50μl，混勻，注入電泳槽中，插入梳，待膠凝固。 （2）預電泳 以1×TBE為上下槽電泳緩沖液，加上電壓后進行預電泳，如果用測序電泳裝置，電壓應達2000v以上，功率設定為100w，溫度設為50 OC。待膠板溫度達50 OC時，暫停電泳，準備加樣。 （3）加樣 將已溶解在加樣緩沖液中的樣品80 OC加熱2min，立即加樣到膠孔中，電泳1-2hr。（電泳條件同預電泳）。 （3） 電泳結束后，打開膠板，用濾紙取下膠，覆上一層保鮮膜，放置于暗盒中，暗室紅光下，壓上一張X片，蓋上暗盒，-70OC曝光1-3天。暴光結束后，將X光片顯影、定影、水洗、晾干。