廣東農業科學 陳弟 多種RNA 提取方法的原理 Trizol法即異硫氰酸胍—苯酚法，異硫氰酸胍可以抑制RNA酶、防止RNA的降解，而酚的作用是使蛋白變性。其原理是內含異硫氰酸胍能迅速破碎細胞，同時使核蛋白復合體中的蛋白變性并釋放出核酸；由于釋放出的DNA和RNA在特定pH值下的溶解度不同，且分別位于中間相和水相，從而使DNA和RNA得到分離；取出水相后，通過有機溶劑(氯仿)抽提及異丙醇沉淀，可得到純凈RNA。 熱硼酸法 (Hot-borate，簡稱HB法)的原理是將硼酸緩沖體系、蛋白酶K消化蛋白和LiC1選擇性沉淀RNA等步驟偶聯在一起。硼酸可與酚類化合物依靠氫鍵形成復合物， 二硫蘇糖 醇(DTT) 作為還原劑， NP-40 可阻止酚類物質氧化，聚乙烯吡咯烷酮(PVP)可與多酚化合物形成復合體，這些物質都可以抑制植物組織中酚類物質的氧化及其與RNA的結合，通過LiC1沉淀剩余的酚類物質，從而與RNA分開。 異硫氰酸胍法(Guanidine Thiocyanate，簡稱GT法)的提取液包括4 mol/L異硫氰酸胍、25 mmol/L檸檬酸鈉( p H 7.0 )、0.5％十二烷基肌酸鈉、0.1 mol/Lβ-巰基乙醇。其中，異硫氰酸胍作為強變性劑使核酸一蛋白結構發生變化，并有效解離核蛋白與核酸的復合體， 與β-巰基乙醇共同對RNase產生強烈的抑制作用，這樣能破裂細胞并迅速釋放核酸，然后通過CsCl梯度密度離心去除DNA，有效地得到總RNA。 十二烷基硫磺酸鈉法(Sodium Dodecyl Sulfate，簡稱SDS法) 的提取液有 0.1 mol/L Tris-HCl (pH8.0)、0.05 mol/L EDTA (pH8.0)、0.5 mol/L NaC1、1.5％SDS、0.01％β-巰基乙醇。 SDS 是一種離子去污劑，能從低離子強度溶液中沉淀核酸與酸性多聚糖；EDTA以螯合二價金屬離子，抑制RNA酶的活性，防止RNA降解；Tris-HCl不僅起緩沖作用，還可防止RNA降解；NaC1溶液可提供緩沖反應環境。在緩沖液中加入抗氧化劑或強還原劑(如β-巰基乙醇)，可以降低酶類(尤其是氧化酶類)的活性。通過苯酚和氯仿等有機溶劑的抽提去除蛋白質、多糖和酚類等雜質后，加入無水乙醇進行沉淀，即可使RNA分離出來。 十六烷基三甲基溴化銨法(Hexadecyltrimethy Ammonium Bromide． 簡稱CTAB法)的抽提緩沖液包括2％ CTAB、100 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)、1.4 mol/L NaC1、20 mmol/L EDTA (pH 8.0)。其中，CTAB作為離子型表面活性劑，能溶解細胞膜和核膜蛋白，使核蛋白解聚，從而使RNA得以游離出來；EDTA以螯合二價金屬離子抑制RNA酶的活性，防止RNA降解；Tris-HCl不僅起緩沖作用，還可防止RNA降解；NaC1溶液提供緩沖反應環境。在緩沖液中加入抗氧化劑或強還原劑(如β-巰基乙醇) ，以降低酶類(尤其是氧化酶類) 的活性。而添加的苯酚和氯仿等有機溶劑能使蛋白質變性并使抽提液分相，由于RNA溶于水相，因此經離心后即可從抽提液中去除細胞碎片和大部分蛋白質；上清液中加入的無水乙醇可使 RNA沉淀，將沉淀出的RNA溶于TE溶液中即得RNA溶液；添加的還原劑(如β-巰基乙醇)和鰲合劑(如PVP) 可防止多酚氧化；低濃度乙醇或醋酸鉀可去除多糖，從而達到高度純化RN A的目的。