１　原理 　　中性粒細胞中的堿性磷酸酶（簡稱堿酶）在一定條件下能使β－甘油磷酸鈉水解釋出無機磷， 后者與鉬酸試劑結合成磷鉬酸復合物， 再以氨基萘酚磺酸還原為鉬藍而呈現藍色，用光電比色法求得所釋放的無機磷含量，表示酶的活性。

　 ２　試劑 　　ａ．葡聚糖：分子量２０萬，用生理鹽水配制成２％溶液，在冰箱中可保存一個月。 　　ｂ．β－甘油磷酸鈉溶液（０．０２６Ｍ）：稱取β－甘油磷酸鈉溶于碳酸—重碳酸鹽緩沖溶液，將ｐＨ調至９．９，液面蓋一層石油醚，在冰箱內保存。 　　ｃ．碳酸－重碳酸鹽緩沖液： 　　Ａ液　稱取無水碳酸鈉２．１２ｇ，溶于重蒸餾水１００ｍｌ，配成０．２Ｍ無水碳酸鈉溶液。 　　Ｂ液　稱取碳酸氫鈉１．６８ｇ，溶于重蒸餾水１００ｍｌ，配成０．２Ｍ碳酸氫鈉溶液。 　　取Ａ液１００ｍｌ與Ｂ液１００ｍｌ混合，加重蒸餾水６００ｍｌ，ｐＨ為９．９。 　　ｄ．皂素：用生理鹽水配成２％溶液。 　　ｅ．氯化鎂溶液（０．０５Ｍ）：用重蒸餾水配成。 　　ｆ．三氯乙酸溶液：用重蒸餾水配成５０％及５％二種濃度。 　　ｇ．鉬酸銨溶液：稱取鉬酸銨１２．５０ｇ，溶于重蒸餾水１００ｍｌ，加１０Ｍ硫酸１５０ｍｌ，再加重蒸餾水到５００ｍｌ。 　　ｈ．０．２５％氨基萘酚磺酸溶液：稱取氨基萘酚磺酸０．０６２５ｇ、亞硫酸氫鈉１．３３ｇ、亞硫酸鈉０．２５ｇ，于研缽中磨成細粉，加重蒸餾水到２５ｍｌ，過濾后保存于冰箱內。用時稀釋一倍。 　　ｉ．標準磷儲備液（每毫升含無機磷１ｍｇ）：　稱取干燥恒重的分析純磷酸二氫鉀２．１９７１ｇ置于容量瓶中，加重蒸餾水至５００ｍｌ，加氯仿２滴，在冰箱內保存。 　　ｊ．肝素：用生理鹽水配成１％溶液。

　 ３實驗方法 　　３．１　白細胞分離 　　自耳垂或手指取血０．１５ｍｌ，置于預先準備好的含１滴肝素和０．３０ｍｌ葡聚糖溶液的微量試管中，用手振搖混勻，靜置１０分鐘。待紅細胞沉降界面清晰時，小心吸出上層懸浮液，置于小離心管中，加入２倍生理鹽水，搖勻后離心（２５００轉／分鐘）８分鐘。取出上清液棄去，保留沉淀。再向有沉淀的離心管加生理鹽水２ｍｌ，混勻，再離心８分鐘。重復２次，棄去上清液，管中留下液體約０．１５ｍｌ，與沉淀混勻，即為白細胞懸浮液， 作白細胞計數２～４次，取其 平均值。 此白細胞懸浮液供酶活性測定之用。如不能立即測定，需放置冰箱內， 但必須在當天測定。 　　３．２　白細胞堿酶活性的測定 　　取一小試管， 加入β—甘油磷酸鈉 ０．８５ｍｌ ， 皂素 ０．０５ｍｌ， 氯化鎂０．０２ｍｌ，于３７℃水浴中預熱５分鐘，然后準確加入白細胞懸浮液０．０５ｍｌ，混勻， 繼續保溫６０分鐘，到時立即加入５０％三氯乙酸０．１５ ｍｌ使反應終止， 以２５００轉／分離心１０分鐘，除去沉淀。 　　每個樣品都需作對照管測定，對照管所加內容物同上，僅白細胞懸浮液須在保溫后加５０％三氯乙酸后加入。 　　分別取樣品和對照管上清液０．８０ｍｌ，各加入鉬酸銨試劑０．１５ｍｌ，氨基萘酚磺酸溶液０．１０ｍｌ，重蒸餾水１．４５ｍｌ，顯色２０分鐘，用分光光度計測定光密度（ 所用波長為６６０ｎｍ、比色杯厚１０ｍｍ ），分別讀取樣品管、對照管的光密度。每管重復讀數兩次，取其平均值。 　　３．３　磷標準曲線的制定 　　取標準磷儲備液， 用５％三氯乙酸稀釋成不同濃度的標準磷應用液， 濃度分別為：１．０，３．０，５．０，７．５，１０．０ｍｇ／１。然后取試管５支，分別在每一試管加入１．０ｍｌ上述標準磷應用液之一種， 以及鉬酸銨０．１５ ｍｌ， 氨基萘酚磺酸０．１０ｍｌ，重蒸餾水１．２５ｍｌ，按上法顯色，讀取 各管的光密度，繪制標準曲線圖。 　　３．４　白細胞分類計數 　　在取血分離白細胞的同時，取１滴血作涂片，瑞氏染色，按常規分類計數嗜中性白細胞的百分比。 　　３．５　計算方法 　　白細胞堿酶活性用單位表示，以每十億個中性白細胞在３７℃條件下，１小時釋放出１ｍｇ無機磷為一個單位。計算公式如下： 　　　酶活性（單位）＝｛〔ｐｉ（樣）—ｐｉ（對）〕×１００００×１．４０｝÷（Ｗ·Ｖ·Ｎ） 式中：ｐｉ（樣）——樣品管無機磷，μｇ； 　　　ｐｉ（對）——對照管無機磷，μｇ； 　　　　　　　Ｗ——白細胞懸液的白細胞數，個／立方毫米； 　　　　　　　Ｖ——酶反應所加入白細胞懸液的量，ｍｌ； 　　　　　　　Ｎ——嗜中性白細胞，％。 　　注：為減少操作誤差，提高結果準確性，也可自靜脈采血１．５ｍｌ，按常量法進行操作。詳見《衛生研究》５（６）：４８１，１９７６。

　 ４　注意事項 　　ａ．白細胞懸液必須充分搖勻，不應有聚集的細胞。白細胞計數要準確，一般應計數２～４次，取平均值。 　　ｂ．堿酶活性測定中，白細胞懸液的加入量要準確，吸取時注意搖勻。 　　ｃ．堿酶反應保溫時間（６０分鐘）要準確。 　　ｄ．顯色反應不應出現沉淀。 　　ｅ．用分光光度計讀數時，樣品管與對照管都應重復兩次。

?