（一）抗原制備 Ig是免疫球蛋白，對異種動物而言，是良好的抗原物質。可以刺激異種動物產生抗Ig血清，經適當提取后，產生抗Ig抗體，又叫第二抗體或抗抗體。在多數的間接標記反應中，均需制備抗Ig抗體。 （二）材料與 試劑 1．提取的動物Ig 2．弗氏完全佐劑和弗氏不完全佐劑 3．青霉素和鏈霉素 4．實驗動物 兔 5．其它材料及 試劑 （三）操作方法 1．免疫方法 可以采用以下各種方法之一進行免疫。 （1）淋巴結注射法：①在兔的兩后足跖部皮下（或皮內）注射活卡介苗50mg（每側約0.30ml）。7～10天后，兔跖及腘肌淋巴結腫大；②于腫大的兩側淋巴結內各注射加有完全 佐劑 的IgG乳化抗原0.50ml(含IgG 5mg/ml、青霉素1 000U/ml、鏈霉素1 000μg/ml)；③必要時，14天后，重復步驟②一次；④再過7天后，于兩側淋巴結內各注射加有完全 佐劑 的IgG乳化抗原0.50ml（含IgG5mg/ml、青霉素1 000U/ml、鏈霉素1 000μg/ml）；⑤5～7天后，耳靜脈采血。測定 血清 效價。 （2）皮下多點注射法：①家兔兩側掌（跖內各注射含有完全佐劑抗原0.10ml（IgG含量5mg/ml）；②7～10天后，脊柱兩側多點（頸、胸、腰椎各兩點、共6點）皮下注射含不完全佐劑的抗原，每點0.50ml；③7～10天后，脊柱兩側重復注射一次；④7～10天后試血。不合格者重復步驟③。 （3）多途徑聯合注射法：①兩側掌（跖）內側皮下注射含完全佐劑抗原0.50ml（IgG量為5mg/ml）；②14天后，多點皮下注射含有不完全佐劑抗原；③7天后，耳靜脈注射不含佐劑的抗原2ml；④測定 血清 抗體效價，不合格者重復步驟③，并適當遞增IgG量。 2．效價測定 采用 瓊脂 擴散法。 ⑴ 將血清倍比稀釋，加入外周孔。 ⑵ 中間孔加動物Ig。 ⑶ 37℃濕盒瓊擴24小時，觀察結果。 （四）結果判定 1．抗Ig的效價測定 瓊脂 擴散效價達1﹕16或1﹕32者為合格。 2．純度鑒定 采用瓊擴法。中間孔加抗Ig血清，外周孔加Ig和標準品Ig。在抗Ig與Ig以及標準品Ig均出現一條沉淀線，且這兩條沉淀線相互融合者，說明提取的Ig是純的。