免疫球蛋白提取 (Immunoglobulin isolation)：IgG的分離與提純

（一）材料與試劑配制

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1 ．動物血清

2 ．硫酸銨飽和溶液

硫酸銨 800g~850g

H 2 O 1 000ml

加熱至絕大部分溶質溶解為止，趁熱過濾，置室溫過夜，然后以 28 ％ NH 4 OH 調 pH 至 7.0 （不調 pH 值也可以）。

注：硫酸銨以質量優者為佳，因次品中含有少量重金屬對蛋白質巰基有影響。如次品必須除去重金屬，可在溶液中通入 H 2 S ，靜置過夜后濾過，加熱蒸發 H 2 S 即可。

3 ． 0.01Mol/L pH7.4PB 液

A 液： 0.10Mol/L NaH 2 PO 4 液

NaH 2 PO 4 · 2H 2 O 15.60g

加 H 2 O 至 1 000.ml

B 液： 0.10Mol/L Na 2 HPO 4 液

Na 2 HPO 4 · 12H 2 O 35.80g

加 H 2 O 至 1 000ml

取 A 液 19ml ， B 液 81ml 加水至 1 000ml 即可。

4 ． 1 ％ BaCl 2 溶液

5 ．納氏液

HgI 115.00g

KI 80.00g

加 H 2 O 至 500.00ml

溶化后過濾，然后再加 20 ％ NaOH500.00ml ，混合即可。

6 ． 0.50 Mol/L 的 HCl 液和 0.50 Mol/L 的 NaOH 液。

7 ．洗脫液： 0.03Mol/L 的 NaCl 液。

8 ．透析袋（或玻璃紙）。

（二）操作方法

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1 ．取 20ml 血清，加生理鹽水 20ml ，再逐滴加入 (NH4 )2 SO 4 飽和溶液 10ml ，使成 20 ％ (NH4 )2 SO 4 溶液，邊加邊攪拌，充分混合后，靜置 30min 。

2 ． 3 000r/min 離心 20min ，棄去沉淀，以除去纖維蛋白。

3 ．在上清液中再加（ NH 4 ） 2 SO 4 飽和溶液 30ml ，使成 50 ％（ NH 4 ） 2 SO 4 溶液，充分混合，靜置 30min 。

4 ． 3 000r/min 離心 20min ，棄上清。

5 ．于沉淀中加 20ml 生理鹽水，使之溶解，再加 (NH4 )2 SO 4 飽和溶液 10ml ，使成 33 ％ (NH4 )2 SO 4 溶液，充分混合后，靜置 30min 。

6． 3 000r/min 離心 20min ，棄上清，以除去白蛋白。重復步驟 5 ， 2~3 次。

7． 用 10ml 生理鹽水溶解沉淀，裝入透析袋。

8． 透析除鹽，在常水中透析過夜，再在生理鹽水中于 4 ℃ 透析 24h ，中間換液數次。

以 1 ％ BaCl 2 檢查透析液中的 SO 4 2- 或以納氏試劑檢查 NH 4 （取 3~4ml 透析液，加試劑 1~2 滴，出現磚紅色即認為有 NH 4 存在），直至無 SO 4 2- 或 NH 4 出現為止。也可采用 SephadexG25 或電透析除鹽。

9． 離心去沉淀（去除雜蛋白），上清液即為粗提 IgG （即 γ 球蛋白，如以 36 ％的飽和硫酸銨沉淀血清的產物即為優球蛋白， Euglobin ，含 γ球蛋白) 。

10 ．過 DEAE －纖維素層析柱。（裝柱過程見層析技術）。以 0.01Mol/L pH7.4PBS （ 0.03Mol/L NaCl ）洗脫，收集洗脫液。

也可采用 SephadexG150 或 G200 柱。

11 ．蛋白質及其定量鑒定（見本章第八節）。

12 ． IgG 的純度鑒定 可采用下列方法之一鑒定。

⑴ 區帶電泳：玻片瓊脂或醋酸纖維膜電泳均可。加樣電泳后，只在 γ—球蛋白的遷移部位出現一條帶。操作時，同時可用全血清樣品，不同濃度 （ NH 4 ） 2 SO 4 鹽析樣品進行電泳，以資比較。

⑵ 瓊脂雙相雙擴散鑒定：預先準備該 IgG 免疫異種動物所獲的抗 IgG 血清。將 IgG 與抗 IgG 血清進行雙相雙擴散，如 IgG 提純的話，則在兩樣品孔之間出現一條沉淀線。

⑶ 免疫電泳鑒定：（操作見第三章免疫電泳部分）。孔內加待測樣品，電泳后，在槽內加抗 IgG 血清，瓊脂擴散 24h ，觀察結果。如果提取的 IgG 純的話，則只出現一條弧形的沉淀線，且沉淀線位于 γ —球蛋白區。此鑒定必須同時進行全血清及抗血清抗體的免疫電泳，以資比較。

⑷ 圓盤電泳鑒定：用全血清樣品及提純樣品同時進行圓盤電泳。全血清樣品在圓盤電泳上出現數十條區帶，而純化的 IgG 則只有一條區帶。

13 ． IgG 的濃縮與保存

⑴ IgG 的濃縮：參看本章第九節。

⑵ IgG 的保存：一般濃縮至 1 ％以上的濃度，再分裝成小瓶凍干保存，或加 0.01 ％硫柳汞在普通冰箱或低溫冰箱保存，注意防止反復凍融。

（三）IgG 的簡易快速提取法

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應用硫酸銨鹽析及 DEAE- 纖維素層析法提純化的 IgG ，不僅操作復雜、需時較長，處理過程中樣品體積大大增加，而且透析時變性嚴重，容易引起抗體效價降低等。為了克服這一不足，特別是當大量提取 IgG 時，則往往采取下列的簡易辦法。

1． DEAE- 纖維素直接提取法

取樣品直接過 DEAE- 纖維素柱。下面介紹的是最為簡單的燒杯法。

⑴ 以一定數量的 DEAE52 放入燒杯中，加入 0.01Mol/L pH8.0PB 緩沖液，靜置 30min ，去上清細粒，再重復一次。

⑵用布氏漏斗（內放兩層濾紙）過濾。

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⑶以 5g 濕重的 DEAE- 纖維素加 1ml 血清及 3ml 蒸餾水混合液的比例，加入各成分，充分攪拌。

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⑷于 4 ℃ 中放置 1h ，中間攪拌數次。

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⑸用布氏漏斗抽濾，再用 0.01Mol/L pH8.0PB 緩沖液沖洗纖維素，抽濾。濾液即為提取的 IgG 液。

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2 ． DEAE － SephadexA － 50 為弱堿性陰離子交換劑，經 NaOH 將 Cl- 型轉變為 OH- 型后，可吸附酸性蛋白，血清中除 γ － G 屬中性蛋白外其余均屬酸性蛋白。當溶液的 pH 在 6.5 時，酸性蛋白均被 DEAE － SephadexA － 50 吸附，只有 γ － G 留在溶液中。因此利用這一原理可以提取 γ － G 。這種提取法流程大大縮短，純化前后樣品體積變化不大，而且所得 γ － G 無變性現象。經過四次處理，其純度也較好。缺點是收集量少，損耗大。

⑴ DEAE — SephadexA — 50 的處理。取 DEAE － SephadexA － 50 若干克，懸浮于蒸餾水中， 1h 后傾去上層小顆粒，然后用 0.50Mol/L NaOH 處理 1h ，蒸餾水洗至中性，再用 0.5 Mol/L HCl 處理 0.5h ，水洗至中性，最后以 0.01Mol/L pH6.5PB 液平衡、抽干。

⑵ 取一定的血清量，加等量的 0.01Mol/L pH6.5PB 液，再加液體體積 1/4 的濾干的 DEAE － SephadexA － 50 ，混合、 4 ℃ 放置 1h ，不時攪拌、抽濾、收集濾液。

⑶ 再用同樣重量的 DEAE － SephadexA － 50 處理濾液。反復處理三次。（全程共四次）。獲得濾液即為 γ － G 制品。

⑷ DEAE － SephadexA － 50 的回收。用 0.5Mol/L 的 Na 2 HPO 4 洗脫，抽濾至濾液中無蛋白（ OD280 ﹤ 0.04 ）后，再用蒸餾水洗至中性即可回收使用。

（四）禽血清IgG 的分離與提純（Na2SO4 法）

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1 ．試劑

⑴ 5 ％葡聚糖硫酸鹽

⑵ 0.02Mol/L MnCl2 溶液

⑶ 無水硫酸鈉

⑷ pH8.2 硼酸鹽緩沖液

⑸ 0.06Mol/L pH7.4PB 液

2 ．操作方法

⑴ 取禽血清 10ml 加 5 ％葡聚糖硫酸鹽液， 0.40ml 和 0.025Mol/L MnCl2 1.00ml 充分混合，靜置，然后離心去沉淀，此步目的是為了去掉脂類物質。

⑵ 于上清液中加無水硫酸鈉使每毫升血清含 0.18g ，緩慢加入，混勻，靜置 30min ， 3 000r/min 離心去上清。

⑶ 以 pH8.2 硼酸鹽緩沖液將沉淀稀釋至原血清的一半再加硫酸鈉使成 0.16g ／ ml ，同上法離心去上清。

⑷ 重復步驟⑶，加 Na2 SO4 ，使成 0.14g /ml 。

⑸ 以少量硼酸鹽緩沖液溶解沉淀，然后裝透析袋除鹽 48h 。

⑹ 過 SephadexG200 柱，收集第一峰和第二峰。第一峰是 IgM ，第二峰主要是 IgG 。

⑺ 如要進一步提純，則用第二峰再過 DEAE —纖維素柱，以 0.06Mol/L pH7.4 PB 液洗脫，洗脫下來的蛋白液即為 IgG 。

也可以按以下操作方法進行：

⑴ 以 18 ％硫酸鈉（ W/V ）提取一次，再以 14 ％的硫酸鈉提取一次。

⑵ 將粗提的免疫球蛋白以 PBS 溶解，按 9 ％加入無水硫酸鈉，離心。再將上清按 5 ％加入無水硫酸鈉，離心。將兩沉淀溶解、混合，在常水中透析過夜，再在生理鹽水中 4 ℃ 透析，直至無 SO 4 2- 為止。

⑶ 離心將上清液以 pH8.0 0.20Mol/L PBS 液平衡。

⑷ 過 SephadexG200 柱，以 pH8.0 0.20Mol/L PBS 液洗脫，收集洗脫液，取第二峰即為雞 IgG 。

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