基因轉染實驗(脂質體介導DNA轉染法)

脂質體（lipofectin regeant，LR）試劑是陽離子脂質體N-[1-2，3-Dioleyoxy， Propyl]-n， n，n-Trimethylammonium Chloride（DOTMA）和Dioleoyl photidye-thanolamine（DOPE）的混合物[1：1（w/w）]。它適用于把DNA轉染入懸浮或貼壁培養細胞中，是目前條件下最方便的轉染方法之一。轉染率高，優于磷酸鈣法，比它高5~100倍，能把DNA和RNA轉染到各種細胞。

用LR進行轉染時，首先需優化轉染條件，應找出該批LR對轉染某一特定細胞適合的用量、作用時間等，對每批LR都要做：第一，先要固定一個DNA的量和DNA/LR混合物與細胞相互作用的時間，DNA可從1~5μg和孵育時間6小時開始，按這兩個參數繪出相應LR需用量的曲線，再選用LR和DNA兩者最佳的劑量，確定出轉染時間（2~24小時）。因LR對細胞有一定的毒性，轉染時間以不超過24小時為宜。

細胞種類：COS-7、BHK、NIH3T3、Hela和Jurkat等任何一種細胞均可作為受體細胞。

1、操作步驟[方法一]：

（1）細胞培養：取6孔培養板（或用35mm培養皿），向每孔中加入2mL含1~2×105個細胞培養液，37℃CO2培養至40%~60%匯合時（匯合過分，轉染后不利篩選細胞）。

（2） 轉染液制備：在聚苯乙稀管中制備以下兩液（為轉染每一個孔細胞所用的量）A液：用不含血清培養基稀釋1-10μg DNA，終量100μL，B液：用不含血清培養基稀釋2-50μgLR，終量100μL，輕輕混合A、B液，室溫中置10-15分鐘，稍后會出現微濁現象，但并不妨礙轉染（如出現沉淀可能因LR或DNA濃度過高所致，應酌情減量）。

（3）轉染準備：用2mL不含血清培養液漂洗兩次，再加入1mL不含血清培養液。

（4）轉染：把A/B復合物緩緩加入培養液中，搖勻，37℃溫箱置6~24小時，吸除無血清轉染液，換入正常培養液繼續培養。

（5）其余處理如觀察、篩選、檢測等與其它轉染法相同。

注意：轉染時切勿加血清，血清對轉染效率有很大影響。

2、快速脂質體轉染法操作步驟如下[方法二]：

（1）以5×105細胞/孔接種6孔板（或35mm培養皿）培養24小時，使其達到50~60%板底面積。

（2）在試管中配制DNA/脂質體復合物方法如下：

①在1mL無血清DMEM中稀釋PSV2-neo質粒DNA或供體DNA。

②旋轉1秒鐘，再加入脂質體懸液，旋轉。

③室溫下放置5~10分鐘，使DNA結合在脂質體上。

（3）棄去細胞中的舊液，用1mL無血清DMEM洗細胞一次后棄去，向每孔中直接加入1mL DNA/脂質體復合物，37℃培養3~5小時。

（4）再于每孔中加入20%FCS的DMEM，繼續培養14~24小時，

（5）吸出DMEM/DNA/脂質體混合物加入新鮮10%FCS的DMEM，2mL/孔，再培養24~48小時。

（6）用細胞刮或消化法收集細胞，以備分析鑒定。

3、穩定的脂質體轉染方法如下：

（1）接種細胞同前，細胞長至50%板底面積可用于轉染。

（2）DNA/脂質體復合物制備轉染細胞同前（2）、（3）步驟。

（3）在每孔中加入1mL、20%FCS的DMEM，37℃培養48小時。

（4）吸出DMEM，用G418選擇培養液稀釋細胞，使細胞生長一定時間，篩選轉染克隆，方法參照細胞克隆篩選法進行。