RNA提取及注意事項

　　目的

　　研究基因的表達和調控時，需要從組織或細胞中分離純化RNA。RNA質量的高低經常影響RT-PCR、cDNA庫構建和Northern Blot等分子生物學實驗的成敗。

　　主要試劑

　　Trizol是一種新型總RNA抽提試劑，內含異硫氰酸胍等物質，能迅速破碎細胞，抑制細胞釋放出的核酸酶。

　　1. Trizol試劑含有苯酚，具有毒性和刺激性，注重操作。

　　2. RNase污染的主要來源是操作過程中手和空氣中的浮沉，注重配帶手套，樣品盡可能蓋嚴。

　　3. 細胞裂解必需充分且操作迅速。裂解不完全會降低最后得率，因為一部分RNA會殘留在未裂解的細胞中。細胞裂解之后要看不見顆粒狀物質（結締組織和骨除外）。在清洗和裂解細胞時最好在低溫下操作，防止在操作過程中釋放的內源RNase降解了RNA。

　　4. 酵母和一些細菌由于細胞壁的特別結構，可以加入Trizol試劑同時加入無RNase的玻璃珠并劇烈振蕩，使細胞裂解充分。

　　2-8℃ 避光保存一年。

　　預備工作

　　RNA酶（Rnase）是導致RNA降解最主要的物質。此酶非常穩定，在一些極端的條件下只可暫時失活，但限制因素去除后又迅速恢復活性。常規高溫高壓滅菌方法和蛋白抑制劑不能使所有的Rnase完全失活。

　　1.它廣泛存在于人的皮膚上，因此制備RNA時必須戴手套

　　2.RNase的又一污染源是取液器。根據取液器制造商的要求對取液器進行處理。一般情況下采用以DEPC配制的70%乙醇擦洗取液器的內部和外部，可基本達到要求。

　　3. 塑料制品、玻璃和金屬物品的處理

　　（1）塑料制品：盡量使用一次性無菌塑料制品。已標明RNase-free的塑料制品，如沒有開封使用過，通常不必再處理。

　　處理的步驟如下：

　　O在玻璃燒杯中注入去離子水，加入DEPC使其終濃度為0.05%~0.1%（DEPC-H2O）。（DEPC二乙基焦碳酸酯為活性很強的劇毒物，須在通風櫥中小心使用）

　　O將待處理的塑料制品放入一個可以高溫滅菌的容器中，注入DEPC-H2O，使塑料制品的所有部分都浸泡到溶液中，在通風柜中37℃ 或室溫下處理過夜。

　　O 將DEPC-H2O小心倒入廢液瓶中，將裝有DEPC -H2O 處理過的塑料制品的容器以鋁箔封口，高溫高壓蒸汽滅菌至少30分鐘。

　　O 滅菌塑料制品烘烤干燥，置潔凈處備用。

　　（2）玻璃和金屬物品250 ℃烘烤3小時以上。