DNA的變性、復性與分子雜交

佚名 ?

?

DNA雙螺旋結構模型，不僅與其生物功能有密切關系，還能解釋DNA的重要特性?變性與復性，這對于深入了解DNA分子結構與功能的關系又有重要意義。

1.DNA變性(denaturation)

　　指DNA分子由穩定的雙螺旋結構松解為無規則線性結構的現象。變性時維持雙螺旋穩定性的氫鍵斷裂，堿基間的堆積力遭到破壞，但不涉及到其一級結構的改變。凡能破壞雙螺旋穩定性的因素，如加熱、極端的pH、有機 試劑 甲醇、乙醇、尿素及甲酰胺等，均可引起核酸分子變性。變性DNA常發生一些理化及生物學性質的改變：

溶液粘度降低。DNA雙螺旋是緊密的剛性結構，變性后代之以柔軟而松散的無規則單股線性結構，DNA粘度因此而明顯下降。

溶液旋光性發生改變。變性后整個DNA分子的對稱性及分子局部的構性改變，使DNA溶液的旋光性發生變化。

15－8　核酸的解鏈曲線

增色效應(hyperchromic effect)。指變性后DNA溶液的紫外吸收作用增強的效應。DNA分子中堿基間電子的相互作用使DNA分子具有吸收260nm波長紫外光的特性。在DNA雙螺旋結構中堿基藏入內側，變性時DNA雙螺旋解開，于是堿基外露，堿基中電子的相互作用更有利于紫外吸收，故而產生增色效應。

對雙鏈DNA進行加熱變性，當溫度升高到一定高度時，DNA溶液在260nm處的吸光度突然明顯上升至最高值，隨后即使溫度繼續升高，吸光度也不再明顯變化。若以溫度對DNA溶液的紫外吸光率作圖，得到的典型DNA變性曲線呈S型(圖15?8)。可見DNA變性是在一個很窄的溫度范圍內發生的。通常將核酸加熱變性過程中，紫外光吸收值達到最大值的50%時的溫度稱為核酸的解鏈溫度，由于這一現象和結晶的融解相類似，又稱融解溫度(Tm,melting temperature)。在Tm時，核酸分子內50%的雙螺旋結構被破壞。特定核酸分子的Tm值與其G＋C所占總堿基數的百分比成正相關，兩者的關系可表示為：

Tm=69.3＋0.41(%G+C)

一定條件下(相對較短的核酸分子)，Tm值大小還與核酸分子的長度有關，核酸分子越長，Tm值越大；另外，溶液的離子強度較低時，Tm值較低，融點范圍也較寬，反之亦然，因此DNA制劑不應保存在離子強度過低的溶液中。

2.DNA復性(renaturation)

指變性DNA在適當條件下，二條互補鏈全部或部分恢復到天然雙螺旋結構的現象，它是變性的一種逆轉過程。熱變性DNA一般經緩慢冷卻后即可復性，此過程稱之為退火(annealing)。這一術語也用以描述雜交核酸分子的形成(見后)。DNA的復性不僅受溫度影響，還受DNA自身特性等其它因素的影響：

溫度和時間。一般認為比Tm低25℃左右的溫度是復性的最佳條件，越遠離此溫度，復性速度就越慢。復性時溫度下降必須是一緩慢過程，若在超過Tm的溫度下迅速冷卻至低溫(如4℃以下)，復性幾乎是不可能的，核酸實驗中經常以此方式保持DNA的變性(單鏈)狀態。這說明降溫時間太短以及溫差大均不利于復性。

DNA濃度。溶液中DNA分子越多，相互碰撞結合的機會越大。

　　DNA順序的復雜性。簡單順序的DNA分子，如多聚(A)和多聚(U)這二種單鏈序列復性時，互補堿基的配對較易實現。而順序復雜的序列要實現互補，則困難得多。在核酸復性研究中，定義了一個Cot的術語，(Co為單鏈DNA的起始濃度，t是以秒為單位的時間)，用以表示復性速度與DNA順序復雜性的關系。在探討DNA順序對復性速度的影響時，將溫度、溶劑離子強度、核酸片段大小等其它影響因素均予以固定，以不同程度的核酸分子重締合部分(在時間t時的復性率)對Cot作圖，可以得到如圖15－9所示的曲線。曲線上方為示復雜性的核酸分子的非重復堿基對數。如多聚(A)的復雜性為1，重復的(ATGC)n組成的多聚體的復雜性為4，分子長度是105核苷酸對的非重復DNA的復雜性為105。原核生物 基因組 均為非重復順序，故以非重復核苷酸對表示的復雜性直接體現基因組大小(圖上方的箭頭所指為基因大小)，對于真核生物基因組中的非重復片段也是如此。在標準條件下(一般為0.18ml/L陽離子濃度，400核苷酸長的片段)測得的復性率達0.5時的Cot值(稱Cot1/2)，與核苷酸對的復雜性成正比。對于原核生物核酸分子，此值可代表基因組的大小及基因組中核苷酸對的復雜程度。真核基因組中因含有許多不同程度的重復序列(repetitive sequence)，所得到的Cot曲線更為復雜。

圖15－9　不同物種核酸的Cot曲線

DNA的變性和復性原理，現已在醫學和生命科學上得到廣泛的應用。如核酸雜交與探針技術，聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction,PCR)技術等。

3.分子雜交：(hybridization)

不同來源的核酸變性后，合并在一處進行復性，這時，只要這些核酸分子的核苷酸序列含有可以形成堿基互補配對的片段，復性也會發生于不同來源的核酸鏈之間，形成所謂的雜化雙鏈(heterodup lex)，這個過程稱為雜交(hybridization)圖15-10，I)。雜交可以發生于DNA與DNA之間，也可以發生于RNA與RNA之間和DNA與RNA之間。例如，一段天然的DNA和這段DNA的缺失突變體(假定這種突變是DNA分子中部丟失了若干堿基對)一起雜交，電子顯微鏡下可以看到雜化雙鏈中部鼓起小泡。測量小泡位置和長度，可確定缺失突變發生的部位和缺失的多少。核酸雜交技術是目前研究核酸結構、功能常用手段之一，不僅可用來檢驗核酸的缺失、插入，還可用來考察不同生物種類在核酸分子中的共同序列和不同序列以確定它們在進化中的關系。其應用當然遠不止于確定突變位置這一例(圖15－10Ⅱ)。

圖15－10　核酸雜交及其應用示意圖?

Ⅰ.變性、復性和雜交。粗細線分別代表不同DNA。A是雜化雙鏈

Ⅱ.突變體的鑒別。B代表天然DNA；C是B的缺失突變體；虛線框內是已缺失的部分；

D是顯示從天然DNA鏈鼓出小泡　Ⅲ.粗線代表探針，粗線上的X表示放射性標記

在核酸雜交的基礎上發展起來的一種用于研究和診斷的非常有用的技術稱探針技術(Probe)。一小段(例如十數個至數百個)核苷酸聚合體的單鏈，有放射性同位素如32P、35S或生物素標記其末端或全鏈，就可作為探針。把待測DNA變性并吸附在一種特殊的濾膜，例如硝酸纖維素膜上。然后把濾膜與探針共同培育一段時間，使發生雜交。用緩沖液沖洗膜。由于這種濾膜能較牢固地吸附雙鏈的核酸，單鏈的在沖洗時洗脫了。帶有放射性的探針若能與待測DNA結合成雜化雙鏈，則保留在濾膜上。通過同位素的放射自顯影或生物素的化學顯色，就可判斷探針是否與被測的DNA發生雜交。有雜交現象則說明被測DNA與探針有同源性(homogeneity)，即二者的堿基序列是可以互補的。例如：想知道某種病毒是否和某種腫瘤有關，可把病毒的DNA制成探針。從腫瘤組織提取DNA，與探針雜交處理后，有雜化雙鏈的出現，就說明兩種DNA之間有同源性。這不等于可以說這種病毒引起腫瘤，但至少這是可以繼續深入研究下去的一條重要線索。

　　探針技術(圖15－10Ⅲ)在遺傳性疾病診斷上已開始應用。例如診斷地中海 貧血 或血紅蛋白病，可以由已確診的病人白細胞中提取DNA，這就是診斷探針。用診斷探針檢查，不但可以對有癥狀患者進行確診，還可以發現一些沒有癥狀的隱性遺傳性疾病。從胎兒的羊水也可以提取到少量DNA。由于探針技術比較靈敏，就使遺傳性疾病的產前診斷較為容易辦得到了。雜交和探針技術是許多分子生物學技術的基礎，在生物學和醫學的研究中，以及臨床診斷中得到了日益廣泛的應用。

?