（1）在0.5ml Eppendorf管中加重蒸水6μl，10×Buffer 1μl，DNA 2μl，酶1μl，混勻，37℃水浴1h以上。 　（2）取反應物點樣，觀察酶切效果。 　　（3）酶切完全后，70℃5min終止反應。 　　（4）加2倍體積的預冷無水乙醇和1/10體積的3mol/l NaAc混勻，-20℃2h以上。 　　（5）15000rpm離心15min，棄上清。 　　（6）加入75%乙醇洗滌2次，離心棄上清，真空抽干。 　　（7）加入適量1×TE溶解。如此可得線性化載體DNA。 　　（8）測定DNA的含量。 　　（9）加入線性載體DNA和含量3～4倍于載體的待插入DNA片段，連接緩沖液及T4連接酶適量至總體積為20μl，在12～14℃反應12～16h。 　　（10）連接反應液可置-20℃保存，供轉化用。

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