PCR相關問題分析

關鍵詞： pcr 相關問題來源：互聯網

本人長期以來從事PCR及載體的重組構建,有什么問題大家可以一起討論交流關于PCR的一些問題： 1．簡介寡聚核苷酸引物的選擇，通常是整個擴增反應成功的關鍵。所選的引物序列將決定PCR產物的大小、位置、以及擴增區域的Tm值這個和擴增物產量有關的重要物理參數。好的引物設計可以避免背景和非特異產物的產生，甚至在RNA-PCR中也能識別cDNA或基因組模板。引物設計也極大的影響擴增產量：若使用設計粗糙的引物，產物將很少甚至沒有；而使用正確設計的引物得到的產物量可接近于反應指數期的產量理論值。當然，即使有了好的引物，依然需要進行反應條件的優化，比如調整Mg2+濃度，使用特殊的共溶劑如二甲基亞砜、甲酰胺和甘油。計算機輔助引物設計比人工設計或隨機選取更有效。一些影響PCR反應中引物作用的因素諸如溶解溫度、引物間可能的同源性等，易于在計算機軟件中被編碼和限定。計算機的高速度可完成對引物位置、長度以及適應用戶特殊條件的其他有關引物的變換可能性的大量計算。通過對成千種組合的檢測，調整各項參數，可提出適合用戶特殊實驗的引物。因此通過計算機軟件選擇的引物的總體“質量”（由用戶在程序參數中設定）保證優于通過人工導出的引物。需要指出的是，引物不必與模板完全同源，因此可包含啟動子序列、限制酶識別位點或5’端的各種修飾，這種對引物的修飾不會妨礙PCR反應，而會在以后使用擴增子時發揮作用。 2．基本PCR引物設計參數引物設計的目的是在兩個目標間取得平衡：擴增特異性和擴增效率。特異性是指發生錯誤引發的頻率。特異性不好或劣等的引物會產生額外無關和不想要的PCR擴增子，在EB染色的瓊脂糖凝膠上可見到；引物效率是指在每一PCR循環中一對引物擴增的產物與理論上成倍增長量的接近程度。 ①引物長度；特異性一般通過引物長度和退火溫度控制。如果PCR的退火溫度設置在近于引物Tm值（引物/模板雙鏈體的解鏈溫度）幾度的范圍內，18到24個堿基的寡核苷酸鏈是有很好的序列特異性的。引物越長，擴增退火時被引發的模板越少。為優化PCR反應，使用確保溶解溫度不低于54℃的最短的引物，可獲得最好的效率和特異性。總的來說，最好在特異性允許的范圍內尋求安全性。每增加一個核苷酸，引物特異性提高4倍；這樣，大多數應用的最短引物長度為18個核苷酸。引物設計時使合成的寡核苷酸鏈（18～24聚物）適用于多種實驗條件仍不失為明智之舉。 ②引物的二級結構包括引物自身二聚體、發卡結構、引物間二聚體等。這些因素會影響引物和模板的結合從而影響引物效率。對于引物的3’末端形成的二聚體，應控制其ΔG大于-5.0kcal/mol或少于三個連續的堿基互補，因為此種情形的引物二聚體有進一步形成更穩定結構的可能性，引物中間或5’端的要求可適當放寬。引物自身形成的發卡結構，也以3’端或近3’端對引物-模板結合影響更大；影響發卡結構的穩定性的因素除了堿基互補配對的鍵能之外，與莖環結構形式亦有很大的關系。應盡量避免3’末端有發卡結構的引物。 ③引物GC含量和Tm值 PCR引物應該保持合理的GC含量。含有50％的G+C的20個堿基的寡核苷酸鏈的Tm值大概在56～62℃范圍內，這可為有效退火提供足夠熱度。一對引物的GC含量和Tm值應該協調。協調性差的引物對的效率和特異性都較差，因為降低了Tm值導致特異性的喪失。這種情況下引物Tm值越高，其錯誤引發的機率也越大。若采用太高的退火溫度，Tm值低的引物對可能完全不發揮作用。在從一批在特定序列范圍內已合成好的寡核苷酸中選擇一對新的引物時，這種GC含量和Tm值的協調非常關鍵。一般來說，一對引物的Tm值相差盡量不超過2～3攝氏度，同時引物和產物的Tm值也不要相差太大，20攝氏度范圍內較好。 ④引物的額外序列與退火溫度若有額外的序列信息要加到引物中，例如T7RNA聚合酶結合位點、限制酶切位點或者GC發夾結構可以使用加長的引物。一般說來，引物5’端添加無關序列不會影響引物特異序列的退火。有時候，引物中添加了大量與模板不配對的堿基，可以在較低退火溫度的條件下進行4到5個擴增循環；然后在假定引物5’端序列已經加入到模板中，計算得出的退火溫度下進行其余的循環。在引物上添加限制酶位點時一個重要的考慮是大多數限制酶的有效切割要求在它們的識別序列的5’端有2至3個非特異的額外堿基，這樣就會增加引物的非模板特異序列的長度。長引物序列的另一個缺點是影響溶解溫度的精確計算，而這對于確定PCR反應時的退火溫度又是必須的。對于低于20個堿基的引物，Tm值可以根據Tm=4(G+C)+2(A+T)計算。而對于較長的引物，Tm值需要考慮動力學參數、從“最近鄰位”的計算方式得到，現有的PCR引物設計軟件大多數都采用這種方式。 ⑤引物的3’末端核苷酸組成引物3’末端和模板的堿基完全配對對于獲得好的結果是非常重要的，而引物3’末端最后5到6個核苷酸的錯配應盡可能的少。如果3’末端的錯配過多，通過降低反應的退火溫度來補償這種錯配不會有什么效果，反應幾乎注定要失敗。 ???? 引物3’末端的另一個問題是防止一對引物內的同源性。應特別注意引物不能互補，尤其是在3’末端。引物間的互補將導致不想要的引物雙鏈體的出現，這樣獲得的PCR產物其實是引物自身的擴增。這將會在引物雙鏈體產物和天然模板之間產生競爭PCR狀態，從而影響擴增成功。 ???? 引物3’末端的穩定性由引物3’末端的堿基組成決定，一般考慮末端5個堿基的ΔG。此值的大小對擴增有較大的影響，負值大，則3’末端穩定性高，擴增效率更高，同時也更易于異位引發。需要注意的是，引物3’末端應盡量避免T。實驗證明，以T結尾的引物即使與T, G或C錯配仍可有效延伸。 ⑥PCR產物的長度及在耙序列內的位置 ???? 所有的計算機程序都提供對PCR產物長度范圍的選擇。一般說來，PCR產物長度對擴增效率有影響。特定的應用情況下，PCR產物長度部分取決于模板材料。預期產物的特定長度經常取決于應用的需要。若目的是建立測定特異DNA片段的臨床檢驗方法，120～300bp的小DNA擴增產物可能是最好的。產物應具有好的特異性和高的產生效率，并含有能用于探針捕捉雜交實驗的足夠信息。這一長度范圍的產物可以通過采用兩步擴增循環方法得到，從而減少擴增時間。其他PCR方法有不同的最佳產物長度。例如，通過定量的RNA-PCR檢測基因表達時，產物應該足夠大以便構成競爭性模板，這樣，產物和競爭物都能夠在凝膠上很容易的分辨出來。這些產物一般在250～750bp范圍內。 ⑦補充說明若在cDNA序列內找尋PCR引物，需特別注意兩點：首先，盡力將引物和產物保持在mRNA的編碼區域內，因為這是生成蛋白質的獨特序列，不像3’末端非編碼區域與許多其他mRNA有同源性；第二，盡力把引物放在不同的外顯子上，以便使RNA特異的PCR產物與從污染DNA中產生的產物在大小上相區別。若PCR的目的是克隆一個基因或cDNA的特異序列，產物的大小是根據具體應用預選的。在這里，計算機程序可以提供關于期望區域側翼選擇引物對的信息。在選擇用來擴增來自不同物種DNA的引物時，應避開mRNA的5’和3’末端非翻譯區序列，因為它們可能沒有任何的同源性。 3．簡并引物設計 ①設計簡并引物時，一定要檢查靶擴增區域選定氨基酸遺傳密碼的簡并度。很顯然，我們期望選擇簡并度最低的氨基酸，達到提高特異性的目的。 ②充分注意物種對于密碼子的偏好性，選擇該物種使用頻率高的密碼子，以降低引物的簡并性。 ③應努力避免3’末端的簡并，對于大多數氨基酸殘基來說，意味著引物3’末端不要位于密碼子的第三位。 ④在一些多義位置使用脫氧次黃嘌呤（dI）代替簡并堿基。 4．測序引物設計當然，測序引物的設計一般都由測序公司來完成，如果需要自己設計的話；那么除了按照上面所提到的引物設計通用標準外，還需要注意兩點： ①測序引物的特異性的標準掌握應該更嚴格一些，也就是說設計時更優先考慮特異性。因為在測序反應中，如果引物與模板在非預期位置退火并引發鏈延伸，會對結果對來很大的干擾甚至造成結果無法識讀。 ②測序引物的Tm值適當高一些。現在大部分測序反應均選用耐熱的測序級DNA聚合酶來催化，并采用PCR的熱循環程序。選用的測序引物的Tm值稍高一些，有助于使反應順利跨過待測模板的二級結構區，也有助于降低非特異反應。 5．探針的設計探針的設計，根據不同的用途各有其設計特點，這里只是就通用的原則進行討論： ①探針的長短一般在20-50核苷酸之間，過長合成成本高，且易出現聚合酶合成錯誤，雜交時間長。太短則特異性下降。 ②注意G和C的含量努力控制在40-60％，同時一種堿基連續重復不超過4個，以免非特異性雜交產生。 ③探針自身序列不能形成二聚體，也不能有“發夾”結構存在，這一點上的要求就要比普通引物設計嚴格得多。 ④如果探針地靶目標是多個基因的混合物，就必須控制該探針與無關基因之間的相似性在70%以下。 ??? 1．一般性原則 ??? (1)長度：15—30bp，其有效長度一般不大于38，否則PCR的最適延伸溫度會超過Taq酶的最佳作用溫度(74度)，從而降低產物的特異性。 ??? (2)G十c含量：應在45％一55％之間，PCR擴增中的復性溫度一般是較低Tm值引物的Tm值減去5—10度。引物長度小于20時，其Tm恒等于4×(G十C)十2×(A十T)。 ??? (3)堿基分布的隨機性：應避免連續出現4個以上的單一堿基。尤其是不應在其3’端出現超過3個的連續G或C，否則會使引物在G十C富集序列區錯誤引發。 ??? (4)引物自身：不能含有自身互補序列，否則會形成發夾樣二級結構。 ??? (5)引物之間：兩個引物之間不應有多于4個的互補或同源堿基，不然會形成引物二聚體，尤應避免3’端的互補重疊。 ?? 特異性：與非特異擴增序列的同源性應小于70％，或少于連續8個的互補堿基。 ??? 2．引物的3’端：引物的3’端很人程度上影響Taq酶的延伸效應，除特殊情況(AS－PCR)外，3’端不應發生錯配。S.Kwok等發現，引物的3’端發生錯配時，A：A使產量下降至l／20，A：G或C：C下降至1／100。當末位堿基是T時，即使錯配也能引發鏈的合成，而為A時錯配的引發效率最低，G、C居間。因此，引物的3’端堿基最好選用A、G、C，而盡可能地避免選用T，尤應避免連續出現2個以上的T。 ? 此外，如果擴增編碼區域，引物的3’端不要終止于密碼了的第3位，因此處易發牛簡并，從而影響擴增持異性。 3．避開引物的二級結構區：某些引物無效的原因是引物重復區二級結構的影響，因此選擇擴增片段時應注意避開二級結構區，有些計算機軟件可幫助確定該區域，如不能避開，則可用7－deaza－2’－脫氧GTP取代‘dGTP，有助干PCR成功。 (責任編輯：大漢昆侖王)

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