四環素 酶聯免疫 分析（ ELISA ）

試劑 盒使用說明書

本試劑盒僅供研究使用。

1?使用目的：

本試劑盒用于 飼料、魚、蝦和肉類組織（如雞、牛肉和豬肉），雞蛋、蜂蜜、牛奶、血清和尿樣中 四環素 殘留的定量檢測 。

2? 實驗原理

本試劑盒采用競爭ELISA 方法，在微孔板包被有 四環素 偶聯抗原，加入 四環素 標準品或樣品，游離 四環素 與微孔條上預包被的 四環素 偶聯抗原互相競爭抗 四環素 抗體酶標記物，用TMB 底物顯色，加入終止液后顏色由藍色變為黃色，用酶標儀在 450nm 波長下進行檢測，吸光值與樣品中 四環素 含量成反比 ，通過標準曲線 計算樣品 中 四環素 的含量。 ??

3? 試劑盒組成?

3. 1?預包被的 四環素 偶聯抗原的可拆酶標板：1 塊（ 12 孔 ×8 條）。 3. 2 四環素 標準品：6 瓶（ 1ml/ 瓶），含量分別是： 0ppb,? 3 ?ppb, 9 ppb, 27 ?ppb, 81 ?ppb ,243 ?ppb

3. 3抗 四環素 抗體酶結合物：1 瓶（ 6ml ）。 3. 4顯色液 A ： 1 瓶（ 6ml ）。 3. 5顯色液 B ： 1 瓶（ 6ml ）。 3. 6終止液： 1 瓶（ 6ml ）， 2M 硫酸。 3. 7樣本稀釋液： 1 瓶（ 10 × ,??6 ml），用于樣品稀釋用。 3. 8濃縮洗滌液： 1 瓶（ 2 0×， 20 ml），用于洗板。 3. 9說明書一份。

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4? 需要而未提供的材料 4.1?設備 4.1.1波長 450nm 酶標儀。? 4.1.2粉碎機。 4.1.3量筒。 4.1.4振蕩器。 4.1.5漏斗。 4.1.6Whatman?No?1或相當的濾紙。 4.1.7微量移液器。 4.2?試劑 4.2.1去離子水或蒸餾水。 4.2.2?甲醇。 5?貯存 5.1?試劑盒貯存于 2~8 ℃ ，切勿冷凍 5.2?未用完的微孔板應該密封干燥保存 6?注意事項 6.1?使用試劑盒前請仔細閱讀說明書。 6.2?不要使用過期試劑盒。 6.3?試劑盒使用前，將試劑恢復至室溫（ 25±2 ℃ ），建議至少回溫2 小時。 6.4?標準品中含有 四環素 ，使用時應特別注意，操作時應帶手套。 6.5?終止液中含有硫酸，使用時防止灼傷皮膚及腐蝕衣物。 6.6?不同標準品、樣品所用吸頭不能混用，否則會影響試驗結果。 6.7?不同批號試劑盒中的試劑不得混用；不同標準品、樣品所用吸頭不得混用，否則會影響實驗結果。 6.8?稀釋樣本時必須用本試劑盒中的樣本稀釋液，否則會影響實驗結果 6.9?混合試劑時應避免起泡。 7?工作液準備 7.1 四環素 標準品溶液：0ppb,? 3 ?ppb, 9 ppb, 27 ?ppb, 81 ?ppb ,243 ?pp

7.2?濃縮洗滌液：用蒸餾水按 1: 2 0(1+ 1 9)稀釋 備用

7.3?樣本稀釋液：備用 7.3?顯色劑：已備用，避免光線直照 7.4?反應終止液：已備用 8?樣品處理程序 （樣品在提取過程中，要嚴格按說明書操作，提取過程中應準確稀釋，否則會出現結果不準確，樣品應當保存在陰涼避光之處及冷藏保存） 8.1取 10g 粉碎的樣品，加? 20ml?70% 甲醇溶液 8.2強力振蕩 3 分鐘 8.3用 Whatman?No?1 濾紙過濾 8.4取 10 0μl處理后的樣品，加入 400μl 樣本稀釋液 8.5取 50μl 稀釋液進行分析（稀釋倍數 10 ） 9?酶免分析步驟 9.1?實驗須知 9.1.1?實驗開始前請將所有試劑于盒外充分恢復至室溫（ 25±2 ℃ ），時間約2 小時。回溫至室溫（ 25±2 ℃ ）后再取出微孔條，多余的微孔條重新密封立即于2~8 ℃ 干燥保存 注：一定保證回溫充分，否則影響檢測的精確度和準確度。 9.1.2?使用后請立即將試劑放回 2~8 ℃ 保存 9.1.3?請不要改變分析程序 9.1.4?請使用精確的微量移液器 9.1.5?操作一旦開始，請不要中斷任何程序 9.1.6?ELISA結果的可重復性極大程度的取決于操作程序，請嚴格按照要求操作 9.1.7?為避免交叉污染，每個標準品和樣品均應使用不同的吸頭加樣 9.1.8?加樣時請勿讓吸頭接觸微孔中的溶液或內表面 9.2?分析步驟 9.2.1?預先進行編號，標記 B0 、標準品和樣品的位置，推薦進行雙孔檢測 9.2.2?取所需數量的微孔（微孔條可拆），將多余板條重新密封并立即放回 2~8 ℃ 保存 9.2.3?樣品稀釋液（ 10× ）、濃縮洗滌液（ 10× ）稀釋成工作液 (蒸餾水或去離子水稀釋 ) 9.2.4?在 B0 孔中加入 50μl0.0? ppb 標準品溶液 9.2.5?在各標準孔中加入 50μl 的標準品溶液 9.2.6?在各樣品孔中加入 50μl 樣品溶液 9.2.7?在所有孔中加入 50μl 的抗 四環素 抗體酶結合物 9.2.8?輕輕晃動反應板幾秒鐘。? 9.3? 37℃ 溫浴 3 0min?（溫浴過程中不時輕拍反應板，可以減少雙孔誤差） 9.3.1?甩掉孔中液體，用洗液洗滌微孔板 5 次，最后一次應在吸水紙上拍打以完全除去孔中液體。 9.4?反應 9.4.1?洗滌程序完成后，立即用微量移液器在每個微孔中先加入 50μl 顯色液 A ，再加? 50μl 顯色液 B ；輕微晃動反應板使之徹底混勻 9.4.2? 37℃ 溫浴10min 9.4.3?每孔中加入 50μl 終止液，混勻 9.4.4?在 450nm 下檢測吸光度，結果在 5min 內讀取。 10?結果計算 10.1定量分析 10.1.1所獲得的每個濃度標準溶液和樣本吸光度值的平均值（ B ）除以第一個標準（ 0 標準）的吸光度值（ B0 ）再乘以 100% ，即百分吸光度值。 B―標準溶液或樣本溶液的平均吸光度值 B0―0? ppb