一、簡介

根據填充基質和樣品分配交換原理不同，離子交換層析，凝膠過濾層析和親和層析是三種分離蛋白質的經典層析技術。

二、技巧和方法

1. 柱層析操作方法的選擇

目前，柱色譜分離的操作方式，主要包括常壓分離、減壓分離和加壓分離3種模式。常壓分離是最簡單的分離模式方便、簡單，但是洗脫時間長。 減壓分離盡管能節省填料的使用量，但是由于大量的空氣通過填料會使溶劑揮發，并且有時在柱子外面會有水汽凝結，以及有些易分解的化合物也難以得到，而且還必須同時使用水泵或真空泵抽氣。 加壓分離可以加快淋洗劑的流動速度，縮短樣品的洗脫時間，是一種比較好的方法，與常壓柱類似，只不過外加壓力使淋洗液更快洗脫。壓力的提供可以是壓縮空氣，雙連球或者小氣泵等。

2. 柱子規格的選擇

市場上有各種規格的柱層析分離柱。柱子長了，相應的塔板數就高，分離就好。目前市場上的柱子，其徑高比一般在1：5~10范圍，在實際使用時，填料量一般是樣品量的30~40倍，具體的選擇要根據樣品的性質和含量進行具體分析。 如果所需組分和雜質的分離度較大，就可以減少填料量，使用內徑相對較小的柱子（如2 cm×20 cm 的柱子）；如果Rf相差不到0.1，就要加大柱子，增加填料量，比如用3 cm 內徑的柱子。

3. 裝柱

柱層析色譜柱的填裝主要有濕法和干法兩種，濕法省事，一般用淋洗劑溶解樣品，也可以用二氯甲烷、乙酸乙酯等，但溶劑越少越好，不然溶劑就成了淋洗劑了。柱子底端的活塞一定不要涂潤滑劑，否則會被淋洗劑帶到淋洗液中，可以采用聚四氟乙烯材料的閥門。 干法和濕法裝柱沒什么實質性差別，只要能把柱子裝實就行。裝完的柱子應該有適度的緊密（太密了淋洗劑流速太慢），并且一定要均勻，不然樣品就會從一側斜著流動。 同時柱中不能有大氣泡，大多數情況下有些小氣泡沒太大的影響，因為只要加壓氣泡就可消失。但是柱子更忌諱的是開裂，開裂會影響分離效果，甚至報廢。

4. 溶劑的選擇

選擇一個合適的溶劑系統是柱層析分離的關鍵。在選用柱層析洗脫劑時首先要考慮三個方面的因素:溶解性（Solubil2ity）、親合性（Affinity）和分離度（Resolution）。 溶劑應選擇價廉、安全、環保的，可以考慮石油醚、乙酸乙酯、二氯甲烷、乙醚、甲醇和正己烷等等。但正己烷價格較高，乙醚很易揮發，二氯甲烷和甲醇與硅膠的吸附是一個放熱過程，易使柱子產生氣泡。其他的溶劑用的相對較少，要依不同需要選擇。 另外值得一提的是，由于我們進行的是痕量分析，淋洗劑的純度必須關注，一般使用農藥殘留級或HPLC級的，如果是分析純的必須進行精制。同時溶劑在過柱后最好回收使用，一方面環保，另一方面也能節省部分經費。

5. 上樣

用少量的溶劑溶解樣品加樣，加完后將底端的活塞打開，待溶劑層下降至石英砂面時，再加少量的低極性溶劑，然后再打開活塞，如此兩三次，一般石英砂就基本是白色的了。 加入淋洗劑，一開始不要加壓，等溶解樣品的溶劑和樣品層有一段距離（2~4 cm），再加壓，這樣避免了溶劑（如二氯甲烷等）夾帶樣品快速下行。 很多樣品在上柱前粘性較大，上樣后在柱上又會析出，這一般都是比較大量的樣品才會出現，是因為填料對樣品的吸附飽和所致。有些樣品溶解性差，能溶解的溶劑（比如DMF，DMSO等）又不能上柱，這樣就必須用干法上柱了。

6. 淋洗液的收集和濃縮

用硅膠作固定相過柱子的原理是一個吸附與解吸的平衡。如果樣品與硅膠的吸附比較強的話，就不容易流出，這時可以采用氧化鋁作固定相。 柱層析后的淋洗液，由于使用了較多的溶劑，必須進行濃縮，如果待測物具有一定的揮發性，最好使用常壓揮發溶劑，否則易導致檢測結果偏低。