核酸原位雜交技術

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分子生物學技術的突飛猛進發展，也推動了病理學的進展。原位雜交 技術時分子生物學領域中最常用的基本技術方法之一，是核酸分子雜交技術中的一種。 核酸原位雜交技術最早應用于60年代末期，但當時僅限于對體外條件下啊核酸分子片段的初步工作，直到1975年才見到較為系統地介紹在細胞內進行原位雜交的技術。而在常規福爾馬林固定，石蠟包埋的組織切片中進行簡便易行的原位雜交則是在80年代中后期。近年來，隨著方法更為完善，應用也更加廣泛，使原來用電鏡和免疫組織方法達到的亞細胞和抗原 決定族水平的分辨能力提高到了核酸分子的水平，將病理組織學觀察到的細胞面貌更直實更微細更精確地展示出來。 核酸原位雜交的基本原理 核酸分子 雜交是只具有一定同源性的兩條核酸單鏈在一定的條件下（適宜的溫度和離子強度等）可按堿基互補原則退火（annealling）形成雙鏈的過程。這一雜交過程具有高度的特異性。 雜交的雙方時待測核酸序列及探針。待測的核酸序列可以是克隆的基因片段，也可以是未克隆化的基因組DNA核細胞總RNA。將核酸從細胞中分離純化后可以在體外與探針雜交（膜上印跡雜交），也可以直接在細胞內進行（原位雜交）。 用于檢測的已知核酸片段稱之為探珍（probe）。為了便于示蹤，探針必須用一定的手段加以標記，以利于以后的檢測。常用的標記物包括放射性核素和非放射性標記物兩大類。檢測這些標記物的方法都是極其靈敏的。 由于DNA分子雙股螺旋在一定條件下可以解開（退火），而解開的雙螺旋經重新配對后又能形成新的螺旋（復性），針對這一生物學特性，就可以用已知的核酸片段去檢測未知的核酸分子，并能確定其所在的部位，達到定位和定量的目的。例如，用特異性的細菌、病毒的核酸作為探針對組織、細胞進行雜交，以便有無該病原體的感染。 原位雜交能在成分復雜的組織中進行單一細胞的研究而不受統一組織中其他成分的影響，因此，對那些細胞數量少而散在分布于其他啊組織中的細胞內DNA或RNA的研究更為方便。 原位雜交不需要從組織中提取核酸，對于組織中含量極低的靶序列有極高的敏感性，并可完整地保護組織和細胞的形態，更能準確地反映出組織細胞的相互關系及功能狀態。 核酸原位雜交的主要過程 核酸原位雜交按檢測物的不同，分為細胞內原位雜交和組織切片內原位雜交。根據所用探針及所要檢測核酸的不同又可分為DNA-DNA,RNA-DNA,RNA-RNA雜交。但不論哪一種形式的雜交，都必須經過五大過程，即組織細胞的固定，預雜交、雜交、沖洗和顯示。 一．組織細胞的固定 進行核酸原位雜交的組織或細胞必須經過固定處理。適宜核酸雜交的理想的固定液應具備下列特點：1.能很好地保護組織細胞的形態。2.對核酸無抽提、修飾與降解作用。3.不改變核酸在細胞內的定位。4.對核酸與探針的雜交過程無阻礙作用。5.對雜交信號無遮蔽作用。6.理化性質穩定、價格低廉。 病理組織學常用的固定液均可用與核酸原位雜交是組織和細胞的固定，但各具優缺點。一般而言，4%多聚加全市應用最為廣泛的固定液之一，它能很好地保持組織或細胞內的RNA，一般固定10-15分鐘RNA的含量比較恒定。10%的甲醛液雖然可促進DNA雙鏈分子的交聯進而變性，但用含50%的甲酰胺雜交液進行雜交可解決。乙醇：冰醋酸（3：1）雖然廣泛用于核酸原位雜交時的組織細胞固定，不過固定后組織細胞內RNA明顯減少，但同時本底也很低。由于固定的時間一是一個影響原位雜交的重要因素，因此還必須根據具體實驗摸索出適合自己要求的固定液與固定時間。 二．預雜交 核酸原位雜交時，由于組織細胞中的核酸都與細胞內蛋白質結合，以核酸蛋白質復合體的形式存在與細胞漿或細胞核中，固定過程中固定液的交聯作用時胞漿或胞核內的各種生物大分子形成網絡，影響探針的穿透力，阻礙雜交體的形成。因此，需進行預雜交的過程，其目的是去除核酸表面的蛋白質，屹立與核酸探針對靶核酸進行雜交。常用去垢劑（detergeat）和/或蛋白酶對組織細胞進行部分的消化酶解以去除核酸表面的蛋白質。常用的去垢劑由Triton-X100和十二烷基碘酸鈉（SDS），常用的蛋白酶有蛋白酶K等。蛋白酶K的純度、濃度、消化的時間在不同的組織細胞中相差極大，因此，必須進行一系列的預試驗，找到適當的濃度及消化時間。 三、雜交 雜交過程是核酸原位雜交技術的主要環節，包括以下重要內容。 1、探針的選擇 核酸原位雜交中所用的探針可以是雙鏈的DNA（dsDNA）也可以是單鏈的DNA（ssDNA）,或為RNA。近年來人工合成的寡核苷酸也得到了廣泛應用。一般而言，標記的DNA或RNA探針都可用于DNA或RNA的定位，其長度為50-300bp（堿基）最好，這個長度范圍的探針在組織細胞中的穿透力好，雜交效率高。常用的探針有： （1）雙鏈DNA探針。常用于雜交的探針之一，可通過切口平移標記或隨機引物標記法標記。后者與前者相比，能產生高比活的探針，但標記探針的產量較低，不適合大量切片的原位雜交。 （2）人工合成脫氧寡核苷酸。可由DNA合成儀合成，與克隆的DNA相比，人工合成脫氧寡核苷酸有下列優點：特異性較高，當DNA順序未知時可按氨基酸順序進行合成，可用于相似基因順序差異研究；可用合成的不同順序探針對特定基因進行最佳雜交條件的篩選；由于分子量小，與相同量的dsDNA探針相對而言，具有高得多的摩爾濃度。 （3）單鏈cDNA探針。單鏈cDNA探針常通過克隆載體M13獲得。ssDNA探針與dsDNA探針相對比，其最大優點在于，ssDNA探針不會像dsDNA探針那樣與自身互補的第二條鏈復性雜交，增加了探針的有效濃度。 （注：M13是大腸桿菌絲狀噬菌體系列中的一個。含有6400個左右的核苷酸單鏈閉環DNA分子。在用作克隆載體時，可以產生大量含有外源性DNA某一條鏈的DNA分子。）