小鼠腦組織蛋白的快速 MALDI 成像

2023-07-05

MALDI-TOF/TOF質譜因其獨特的靈活和方便，被用于動物組織中的完整蛋白或蛋白原位酶切的組織成像。完整蛋白成像提供了各種蛋白異變體的信息，蛋白原位酶解成像利用TOF高分辨率和準確度以及MS/MS信息確認酶切肽。

前言

近年來，以MALDI-TOF/TOF質譜為核心的MALDI質譜成像（MSI）在臨床研究應用日趨廣泛，該系統為組織成像應用提供了獨特的多種功能。MALDI-TOF質譜儀具有質量范圍寬，能夠對從小分子藥物到大分子完整蛋白質的各種類型分子進行成像實驗。MALDI-TOF質譜對特征蛋白的組織成像，被證明具有高度區分組織亞型的能力，例如不同發展階段的腫瘤組織^[1]。

MALDI-MSI的蛋白成像可以多種方法進行。對完整蛋白的分析揭示了各種蛋白異變體的空間分布，他們可以是與某個生物途徑有關的特定修飾。例如，組蛋白特征位點甲基化和乙酰化水平可作為“組蛋白密碼”。過去的研究展示MALDI-TOF成像可以很好地解析動物腦組織中組蛋白空間分布^[2]。蛋白組織原位酶切后的Bottom-up蛋白成像是完整蛋白成像的補充，因為它可以檢測更大的蛋白質，它們用完整蛋白成像難以檢測。此外，酶切肽在MALDI-TOF反射模式下的高分辨率測量，可以得到更好的質量準確度，其MS/MS提供了肽成像的分子鑒定信息。本應用展現了使用Top-down和Bottom-up工作流程對小鼠腦組織中的蛋白質進行MALDI成像的能力。

實驗樣本由慕尼黑路德維希·馬克西米利安大學生物醫學中心提供。新鮮冷凍小鼠腦組織的矢狀切片。切片置于布魯克導電載玻片上，對于完整蛋白成像，玻片上預涂有聚賴氨酸。完整蛋白成像的樣本成像前需用Carnoy方法清洗載玻片上的組織切片，然后用芥子酸（SA）基質進行噴霧。Bottom-up蛋白成像用胰酶進行蛋白的組織原位酶切，然后通過HTX基質噴霧儀施加HCCA基質。

布魯克rapifleX TOF/TOF質譜儀用于所有MALDI成像數據采集，獲得分子量在2000- 24000的完整蛋白質譜圖和分子量在600-2400蛋白原位酶切MS/MS譜圖。空間分辨率為30μm。SCiLS? Lab軟件用于成像數據的圖像處理和統計分析。

結果和討論

圖1和圖2顯示了小鼠大腦完整蛋白成像的結果。數據分析的第一步，使用無監督多元統計分析進行空間分割^[3]。圖1所示的分割圖反映了小鼠大腦中各個解剖區域像小腦、皮層和其他區域的分子相似性。圖1還顯示了小鼠大腦各區域在TIC歸一化后的特異蛋白質譜。通過有監督單變量統計，即受試者操作特征（ROC），進一步研究了空間分割產生的小鼠大腦皮層和小腦兩個不同的聚類，以確定可以明顯區別皮層或小腦的某些蛋白。圖2頂部的曲線下面積（AUC）與m/z的關系圖揭示了與m/z特征匹配的各種組蛋白，表明在皮層和小腦這些蛋白的表達水平存在顯著差異。圖2中把小腦或皮層兩個區域的TIC歸一化平均光譜重疊，看到ROC分析檢測到的組蛋白空間分布差異進一步顯現。小腦平均光譜表明，與皮層平均光譜相比，相應組蛋白的豐度顯著增加。另外，MS信號的精細結構解析反映了組蛋白組織特異性的修飾譜信息，代表了Top-down成像方法的獨特結果。在四個組蛋白區域中的每個區域，都選擇了一個代表性m/z，并生成各自的離子圖像（圖2下）。這些圖像再次證實了ROC結果，并說明這些蛋白質物種在小腦區域明顯的共定位。這里的Top-down蛋白成像結果與Lahiri等人^[2]早些時候報告的用布魯克ultrafleX III儀器獲得的數據完全一致。而rapifleX MALDI-TOF/TOF以幾乎兩倍ultrafleX III的像素分辨率進行成像, 采集速度提高約14倍。

圖1. 小鼠大腦矢狀切面完整蛋白MALDI成像。空間分割2個不同區域的光學圖像（左上）；分割圖（左中）；分割樹（左下）。空間分割總測量區域（右上）、小腦（右中）和皮層（右下）的平均光譜。

圖2:完整蛋白MALDI成像的ROC分析，分割圖中小腦和皮層區域的比較。ROC圖, 灰色m/z范圍是組蛋白區域（上），小腦（棕色）和皮層（藍色）組蛋白放大區域的疊加平均光譜,（中）, 各種組蛋白的離子圖像（下）。

圖3-5總結了新鮮冷凍小鼠腦切片胰酶酶切后的肽成像結果。肽譜圖相似性分析給出了空間分割，顯示了小鼠大腦的解剖結構（圖3）。特別是分割圖中紅色的聚類清楚地代表小腦區域。選擇MS成像中檢測到的不同的肽，進行組織原位MS/MS分析，然后用MASCOT搜庫得到的肽序列如圖3所示。

圖3：小鼠腦矢狀切片獲得的胰酶切蛋白成像的空間分割。和分割提取小腦區域重疊的光學圖像（左上）,分割圖（左中）,分割樹（左下）. 總測量區域（右上）和小腦的平均光譜（右下）. 列表顯示了組織原位MS/MS鑒定的肽。

圖4：胰酶切肽m/z 931.5+/-0.2Da的離子圖像, 豐度最高的區域原位MS/MS用于鑒定組蛋白3.3的酶切肽序列ARTKQTAR。

其中一個被鑒定的肽是源自組蛋白3.3（Mus musculus）的ARTKQTAR m/z 931.54，圖4 是它的MS離子圖像，以及從最高豐度區域組織的肽原位MS/MS光譜。組蛋白3.3酶切肽在小腦區域的定位與之前描述的完整蛋白成像中觀察到的H3組蛋白的空間分布高度一致。為了進一步證明這些結果，采集了酶切肽m/z 931.54的MS/MS圖像，其最豐富肽碎片（[b+18]7，m/z 775.4）的空間分布如圖5所示。所得的MS/MS圖像再次顯示了組蛋白3.3酶切肽在小腦區域的明顯定位，這與完整蛋白以及上述肽MS成像結果完全一致。

圖5：組蛋白3.3胰酶切肽ARTKQTAR m/z 931.5的MS/MS圖像，MS/MS譜圖中生成MS/MS圖像的最豐富的碎片離子[b+18]7(紅色箭頭)。

布魯克rapifleX MALDI-TOF/TOF質譜作為一個獨特的多功能分析平臺，能夠對不同階段的蛋白質進行MALDI組織成像, 包括Top-down完整蛋白成像和胰酶切肽MS成像，以及組織原位MS/MS肽鑒定和酶切肽MS/MS成像。這些工作流程可以提供相互補充的信息。雖然Top-down的方法在檢測單個蛋白變異體的能力是獨特的，但酶切肽的MS和MS/MS成像增加了額外的特異性維度，并允許通過MS/MS分辨重疊的同重肽分子。本實驗對小鼠腦組織中組蛋白和其他蛋白質的空間分布，顯示了rapifleX多種 MALDI成像方法的能力。結合HTX基質噴霧儀和SCiLS? Lab分析軟件，rapifleX可作為高空間分辨快速MALDI組織成像系統的首選。

參考文獻

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